< p class = "jove_title" >
1. توليد الأجنة من خلال التزاوج الطبيعي
- زراعة الأجنة حتى عمر 3 أشهر ، والنضج الإنجابي.
- افصل الأسماك البالغة من الذكور والإناث عن السلالة المرغوبة إلى أحواض تزاوج مقسمة في المساء السابق لجمع الأجنة ، وأضف 2 ذكور و 3 إناث إلى كل حوض.
ملاحظة: سمح استخدام سلالة الأنسولين المعدل وراثيا 2a: mCherry بتحليل خلايا β البنكرياس.
- انقل الأسماك إلى خزان التزاوج بمياه النظام العذبة وقم بإزالة المقسم فور إضاءة الأضواء في صباح اليوم التالي.
- اسمح للأسماك بالتزاوج بشكل طبيعي حتى يتم ملاحظة الأجنة في الخزان السفلي. اجمع الأجنة على فترات 30 دقيقة حتى يتم جمع الكمية المطلوبة. قم بتخزين كل نقطة زمنية مجمعة في أطباق بتري منفصلة في وسط الجنين عند 28.5 درجة مئوية.
- إجراء الحقن المجهري للمادة الوراثية أو وضعها في وسط المزرعة التجريبية ، إذا رغبت في ذلك ، وزراعة الأجنة في وسط جنين هانك الطازج في أطباق بتري مقاس 10 سم عند 28.5 درجة مئوية < / >
ملاحظة: لتحليل التعبير الجيني في مورفولينو (MO) المحقونة أو المتحولة ، لاحظ أن كل معالجة قد يكون لها تأثيرات عرضية على التعبير الجيني. يمكن أن تظهر الطفرات تعويضا جينيا على مستوى النسخ الذي لا يتم ملاحظته من خلال استهداف الجينات المستندة إلى MO.
< p class = "jove_title" >
2. مرحلة الأجنة
- استزراع الأجنة في مجموعات من 50-75 جنينا لكل طبق بتري 10 سم لتعزيز توقيت النمو المتسق لجميع الأجنة.
- راقب التشكل التنموي باستخدام مجهر تشريح في مراحل blastomere و epiboly و somite لضمان تقدم النمو.
ملاحظة: قم بإزالة أي أجنة محتضرة أو مشوهة لمنع تأخر النمو في الطبق.
- افصل الأجنة بناء على عمر النمو. قم بتنظيم الأجنة واليرقات باستخدام إجمالي طول الجسم بعد 24 حصانا في القدم < / >
ملاحظة: الجسيدات هي نسيج الأديم المتوسط على شكل شيفرون الموجود في الجزء الظهري من الجنين.
