$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. تحضير العينة
- تحضير مزيج الاغاروز
- قبل 15 دقيقة من صنع مزيج الاغاروز ، قم بإذابة 1 مل من 1٪ من الاغاروز نقطة انصهار منخفضة (مذاب في وسط E3) في كتلة تسخين مضبوطة على 70 درجة مئوية. بمجرد أن يذوب الاغاروز تماما ، انقل 600 ميكرولتر إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل ، وأضف 250 ميكرولتر من وسط E3 ، و 50 ميكرولتر من 0.4٪ MS-222 و 25 ميكرولتر من محلول مخزون الخرزة الدوامة.
ملاحظه: هذا يجعل 925 ميكرولتر من المزيج ، بينما يتم حساب 75 ميكرولتر إضافيا للسائل المضاف لاحقا مع الأجنة.
- احتفظ بالأنبوب في كتلة تسخين ثانية عند 38-40 درجة مئوية أو تأكد من أن الاغاروز قريب جدا من نقطة التبلور قبل وضع عينة من الأجنة فيه.
- تركيب الأجنة
- خذ خمسة شعيرات دموية زجاجية بحجم 20 ميكرولتر (مع علامة سوداء ، ~ 1 مم قطر داخلي) وأدخل غطاسات طرف التفلون المطابقة فيها. ادفع المكبس عبر الشعيرات الدموية بحيث يكون طرف التفلون في الجزء السفلي من الشعيرات الدموية.
- انقل خمسة أجنة (رقم يمكن تركيبه مرة واحدة) بماصة زجاجية أو بلاستيكية إلى أنبوب مزيج الاغاروز الدافئ الدوامي 37 درجة مئوية.
ملاحظه: حاول أن تحمل الحد الأدنى من السائل مع الأجنة.
- أدخل الشعيرات الدموية في المزيج وامتص جنينا واحدا بالداخل عن طريق سحب المكبس لأعلى. تأكد من دخول رأس الجنين إلى الشعيرات الدموية قبل الذيل. تجنب أي فقاعات هواء بين المكبس والعينة. يجب أن يكون هناك ±2 سم من الاغاروز فوق الجنين و ±1 سم تحته. كرر مع الأجنة المتبقية.
- انتظر حتى يتجمد الاغاروز تماما ، وهو ما يحدث في غضون بضع دقائق ثم قم بتخزين العينات في وسط E3 ، عن طريق لصقها على جدار الدورق بالبلاستيسين أو الشريط. يجب أن تكون الفتحة السفلية للشعيرات الدموية معلقة مجانا في المحلول مما يسمح بتبادل الغاز للعينة.
ملاحظة: يمكن أيضا العثور على بروتوكول مشابه للقسمين 1.1 و 1.2 على صفحة ويكي OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.
< p class = "jove_title" >
2. عينة تحديد المواقع
- مجموعة حامل العينة
- أدخل 2 أكمام بلاستيكية بالحجم المناسب (أسود) ضد بعضها البعض في جذع حامل العينة. يجب أن تواجه جوانبهم المشقوقة للخارج. قم بتوصيل المسمار المشبك بشكل غير محكم عن طريق تدويره 2-3 جولات. أدخل الشعيرات الدموية من خلال المسمار المشبك وادفعها عبر الحامل حتى يصبح شريط اللون الأسود مرئيا على الجانب الآخر. تجنب لمس المكبس.
- شد المسمار المشبك. ادفع 1 سم من الاغاروز الزائد أسفل الجنين خارج الشعيرات الدموية واقطعه. أدخل الجذع في قرص حامل العينة.
- تأكد في البرنامج من أن مرحلة المجهر في وضع التحميل. استخدم قضبان التوجيه لتحريك الحامل بالكامل مع العينة عموديا لأسفل في المجهر. قم بتدويره بحيث يتم تثبيت قرص الحامل المغناطيسي في موضعه.