إعداد عينة الفحص المجهري للورقة الخفيفة: تركيب أجنة أسماك الزرد الحية للتصوير طويل الأمد

الملخص

المصدر: Icha J. ، et al. باستخدام الفحص المجهري الفلوري للورقة الخفيفة لتصوير تطور عين الزرد. J. Vis. Exp. (2016).

توضح هذه المقالة تحضير العينة للفحص المجهري الفلوري للصفائح الخفيفة. كما يوضح طريقة لتركيب أجنة الزرد الحية للتصوير طويل الأمد ، مما يسمح بتسجيل أفلام طويلة الأمد للأجنة الحية في ظروف شبه فسيولوجية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير العينة

1. تحضير مزيج الاغاروز
   1. قبل 15 دقيقة من صنع مزيج الاغاروز ، قم بإذابة 1 مل من 1٪ من الاغاروز نقطة انصهار منخفضة (مذاب في وسط E3) في كتلة تسخين مضبوطة على 70 درجة مئوية. بمجرد أن يذوب الاغاروز تماما ، انقل 600 ميكرولتر إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل ، وأضف 250 ميكرولتر من وسط E3 ، و 50 ميكرولتر من 0.4٪ MS-222 و 25 ميكرولتر من محلول مخزون الخرزة الدوامة.
      ملاحظه: هذا يجعل 925 ميكرولتر من المزيج ، بينما يتم حساب 75 ميكرولتر إضافيا للسائل المضاف لاحقا مع الأجنة.
   2. احتفظ بالأنبوب في كتلة تسخين ثانية عند 38-40 درجة مئوية أو تأكد من أن الاغاروز قريب جدا من نقطة التبلور قبل وضع عينة من الأجنة فيه.
2. تركيب الأجنة
   1. خذ خمسة شعيرات دموية زجاجية بحجم 20 ميكرولتر (مع علامة سوداء ، ~ 1 مم قطر داخلي) وأدخل غطاسات طرف التفلون المطابقة فيها. ادفع المكبس عبر الشعيرات الدموية بحيث يكون طرف التفلون في الجزء السفلي من الشعيرات الدموية.
   2. انقل خمسة أجنة (رقم يمكن تركيبه مرة واحدة) بماصة زجاجية أو بلاستيكية إلى أنبوب مزيج الاغاروز الدافئ الدوامي 37 درجة مئوية.
      ملاحظه: حاول أن تحمل الحد الأدنى من السائل مع الأجنة.
   3. أدخل الشعيرات الدموية في المزيج وامتص جنينا واحدا بالداخل عن طريق سحب المكبس لأعلى. تأكد من دخول رأس الجنين إلى الشعيرات الدموية قبل الذيل. تجنب أي فقاعات هواء بين المكبس والعينة. يجب أن يكون هناك ±2 سم من الاغاروز فوق الجنين و ±1 سم تحته. كرر مع الأجنة المتبقية.
   4. انتظر حتى يتجمد الاغاروز تماما ، وهو ما يحدث في غضون بضع دقائق ثم قم بتخزين العينات في وسط E3 ، عن طريق لصقها على جدار الدورق بالبلاستيسين أو الشريط. يجب أن تكون الفتحة السفلية للشعيرات الدموية معلقة مجانا في المحلول مما يسمح بتبادل الغاز للعينة.
      ملاحظة: يمكن أيضا العثور على بروتوكول مشابه للقسمين 1.1 و 1.2 على صفحة ويكي OpenSPIM http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation.

< p class = "jove_title" >2. عينة تحديد المواقع

1. مجموعة حامل العينة
   1. أدخل 2 أكمام بلاستيكية بالحجم المناسب (أسود) ضد بعضها البعض في جذع حامل العينة. يجب أن تواجه جوانبهم المشقوقة للخارج. قم بتوصيل المسمار المشبك بشكل غير محكم عن طريق تدويره 2-3 جولات. أدخل الشعيرات الدموية من خلال المسمار المشبك وادفعها عبر الحامل حتى يصبح شريط اللون الأسود مرئيا على الجانب الآخر. تجنب لمس المكبس.
   2. شد المسمار المشبك. ادفع 1 سم من الاغاروز الزائد أسفل الجنين خارج الشعيرات الدموية واقطعه. أدخل الجذع في قرص حامل العينة.
   3. تأكد في البرنامج من أن مرحلة المجهر في وضع التحميل. استخدم قضبان التوجيه لتحريك الحامل بالكامل مع العينة عموديا لأسفل في المجهر. قم بتدويره بحيث يتم تثبيت قرص الحامل المغناطيسي في موضعه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مجهر Lightsheet Z.1 الفحص المجهري لكارل زايس انخفاض نقطة الانصهار الاغاروز روث 6351.1 انخفاض نقطة الانصهار الاغاروز سيغما A4018 أو A9414 إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات (MESAB / MS-222 / Tricaine) سيغما [إ10521] 20 ميكرولتر (قطر داخلي 1 مم ، أسود مميز) وسم 701904 تباع كقطعة غيار ل TransferPettor غطاسات طرف تفلون ل 20 ميكرولتر شعرية وسم 701932 تباع كقطعة غيار ل TransferPettor