$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< ص الفئة = "jove_title" >
1. تحضير الأجنة
- بعد التزاوج ، احصد الأجنة في E3 في طبق بتري واحتضانها عند 26.5 درجة مئوية لمدة 28 ساعة تقريبا قبل التركيب.
ملاحظه: يؤدي هذا إلى إبطاء نمو الأجنة بحيث تكون الأجنة في مرحلة 30 جسيمة تقريبا في بداية التصوير.
- تخدير الأجنة في 0.016-0.020٪ تريكايين في E3. لتثبيط التصبغ ، أضف PTU إلى تركيز 200 ميكرومتر.
- قم بإزالة الأجنة باستخدام ملقط تحت المجهر التشريح. باستخدام ملقطين ، أمسك المشيمة واسحبها برفق لتحرير الجنين.
< p class = "jove_title" >
2. تصاعد في agarose
ملاحظة: تتطلب طريقة التركيب المطورة تركيزين مختلفين من الاغاروز منخفض الذوبان في E3 مع 0.02٪ Tricaine و PTU حسب الحاجة. يحتوي محلول الاغاروز الأول على تركيز مثالي من الاغاروز حيث يكون التشويه والحركة في الحد الأدنى. يتم وصف التحسين في الخطوة 5 أدناه.
- تسخين محاليل الاغاروز للطبقتين (التركيز المحدد في الخطوة 5 أدناه و 1٪) إلى 65 درجة مئوية. دع الاغاروز يبرد إلى حوالي 30 درجة مئوية قبل التركيب مباشرة حتى لا يتضرر الجنين من الحرارة. للتركيب ، استخدم أطباق قاع زجاجي مقاس 35 مم مع غطاء زجاجي بغطاء قاع رقم 0. يخلق زجاج الغطاء المتصل بقاع الطبق بئرا ضحلا بحجم 10 مم (بعمق 1.2 مم تقريبا) ، حيث يتم وضع الجنين.
ملاحظه: في هذه الحالة ، كان التركيز بأقل حركة وتشوهات بين 0.025 إلى 0.040٪ agarose.
- ضع جنينا منزوعا برفق مع أحد جوانبه الجانبية باتجاه قاع الطبق باستخدام ماصة زجاجية أو ماصة دقيقة. في حالة استخدام ماصة دقيقة ، قم بقص الجزء الخارجي من الطرف لزيادة حجم الفتحة لتناسب الجنين (الشكل 1 أ). قم بإزالة أي E3 متبقي بعناية باستخدام ماصة دقيقة.
- أضف محلول الاغاروز الأول إلى البئر الصغير الذي تم إنشاؤه بواسطة زجاج الغطاء المتصل بقاع الطبق لتغطية الجنين (الطبقة 1) (الشكل 1 ب). تأكد من أن الاغاروز يغطي البئر الصغير ولكنه لن يفيض.
- قم بتغطية البئر الصغير بغطاء زجاجي (22 مم × 22 مم) (الشكل 1 ج) لإنشاء مساحة ضيقة مملوءة بالأغاروز مع الجنين بين كأسي الغطاء.
- ضع طبقة من محلول الاغاروز بنسبة 1٪ فوق زجاج الغطاء في جميع أنحاء قاع الطبق (الطبقة 2) (الشكل 1 د). عندما تصلب هذه الطبقة ، فإنها تثبت زجاج الغطاء في مكانه.
- املأ الجزء المتبقي من الطبق ب E3 الذي يحتوي على 0.02٪ تريكايين للحفاظ على رطوبة النظام (الطبقة 3) (الشكل 1E).
ملاحظه: في هذا الإعداد ، يحمي زجاج الغطاء و 1٪ agarose الطبقة السفلية من التخفيف.
3. تحسين محلول الاغاروز للطبقة 1
- لتحديد التركيز الأمثل للأغاروز للطبقة 1 ، استخدم نهج البحث عن الشبكة متعدد المقاييس. تركيب الأجنة بتركيزات متزايدة من الاغاروز تتراوح من 0.01٪ إلى 1٪ متبوعا بتصوير بفاصل زمني لتقييد نمو الجنين وحركته في مجال الرؤية. حدد التركيزات التي يكون فيها كل من التشويه والحركة في الحد الأدنى.
- لتحسين تركيز الاغاروز بشكل أكبر ، قم بتركيب الأجنة باستخدام مجموعة أدق من تركيزات الاغاروز (على سبيل المثال ، بين 0.025 و 0.040٪ agarose) اعتمادا على التركيز الذي وجد أنه الأفضل في الخطوة 3.1 (على سبيل المثال ، 0.025٪ ، 0.028٪ ، 0.031٪ ، إلخ). < / >
ملاحظه: في مختبرنا ، كان تركيز الاغاروز الأمثل حوالي 0.03٪.
