تركيب أجار: طريقة أساسية لتركيب أجنة أسماك الزرد الحية للتصوير طويل الأمد

Abstract

المصدر: Hagedorn E. J., et al. توليد أجنة الزرد البارابايوتيك عن طريق الاندماج الجراحي للأريمية النامية. J. Vis. Exp. (2016).

يصف هذا الفيديو إرشادات خطوة بخطوة حول تركيب أجنة الزرد الحية على 6 صفيحات آبار باستخدام الاغاروز منخفض الذوبان. كما يوفر عملية الحصول على صور للأجنة الحية وتحليلها باستخدام البرنامج.

Protocol

< p class = "jove_title" >1. إعداد المجهر والحصول على الصور ومعالجتها وتحليلها

1. تحضير 0.8٪ من الاغاروز نقطة انصهار منخفضة (LMP): أضف 0.8 جم LMP agarose إلى 100 مل E3 وسخنها حتى تذوب تماما. بينما تكون ساخنة ، قم بتناول 1 مل من LMP agarose في أنابيب ميكروفوج سعة 1.5 مل في كتلة تسخين 37 درجة مئوية. سيبقى LMP agarose منصهرة عند 37 درجة مئوية. أضف 40 ميكرولتر من 4 مجم / مل (25x) ، درجة الحموضة 7.0 tricaine لكل 1 مل من LMP agarose عند 37 درجة مئوية. ملاحظة: إذا كنت تعمل مع سلالة مصطبغة ، أضف 20 ميكرولتر من 0.15٪ (50x) PTU إلى كل 1 مل.
   1. قم بتخزين ما تبقى من LMP agarose لعدة أشهر في أنابيب محكمة الغلق سعة 50 مل عند 4 درجات مئوية.
2. تخدير الأجنة البارابايتية المراد تصويرها بإضافة 1 مل من 4 مجم / مل (25x) ، درجة الحموضة 7.0 tricaine إلى 25 مل من E3 الموجودة بالفعل في الأجنة.
3. قم بتدوير الطبق برفق حتى تتجمع الأجنة في المنتصف. بعد ذلك ، باستخدام ماصة نقل بلاستيكية عريضة الرأس ، اسحب الأجنة في أقل قدر ممكن من السائل. اقلب الماصة في وضع مستقيم وارتجد الأجنة برفق حتى تستقر في قاع الماصة.
   1. مع وجود الأجنة في قاع الماصة ، انقلها إلى 1 مل من LMP agarose عن طريق لمس طرف الماصة برفق على سطح الاغاروز. تجنب نقل السوائل الزائدة لأن ذلك سيخفف من الاغاروز.
4. بعد طرد السائل الزائد من الماصة ، استخدم الماصة لخلط الأجنة برفق داخل الاغاروز ، ثم استخدم الماصة لنقل كل الأغاروز والأجنة إلى بئر قاع زجاجي (رقم 1.5 غطاء) ، لوحة 6 آبار.
   ملاحظه: تأكد من التخلص من الماصة بعد نقل الأجنة إلى لوحة التصوير. سيتم وضع الأغاروز المتبقي داخل الماصة، مما يجعلها غير فعالة للاستخدام مرة أخرى. بدلا من ذلك ، استخدم ماصة جديدة في كل مرة.
5. تحت المجسم ، استخدم طرف ماصة محملة بالهلام مثبتا في نهاية إبرة إغاظة ذات مقبض خشبي لوضع الأجنة لأسفل باتجاه زجاج الغطاء (للتأكد من أنها تقع ضمن مسافة العمل لهدف المجهر) وفي الاتجاه المطلوب للتصوير.
   ملاحظه: أعد وضعه باستمرار حتى يتماسك الاغاروز بالكامل. احرص على تركيب الأجنة المجاورة للحيوية التي سيتم تصوير جنين الزوج وفقا لها. بالنظر إلى الاتجاه العشوائي للأجنة الملتصقة ، قد يكون من الصعب بالنسبة لبعض الأزواج تصوير كلا الجنينين. في هذا السيناريو ، استرجع الأجنة من الاغاروز باستخدام ملقط وماصة نقل بلاستيكية عريضة الرأس ثم أعد تركيبها للتصوير من منظور مختلف.
6. بمجرد أن يتماسك الاغاروز ، قم بتغطيته ب 2-3 مل من E3 مكمل بطبقة التريكيين (و PTU إذا لزم الأمر).
7. قم بتصوير الأجنة باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب واسع المجال أو مجهر كونفوكالي بالمسح بالليزر أو قرص دوار. حدد الهدف الأنسب للتصوير المطلوب. للحصول على مجال رؤية للجنين الكامل ، استخدم هدف 4x. حدد تكبيرا أعلى، مثل هدف 20x، لتصوير نسيج معين
   ملاحظه: في حالة استخدام مجهر عمودي ، قم بتركيب أغاروز LMP (على غرار ما ورد أعلاه) على زلة غطاء زجاجي. اقلب الغطاء الزجاجي على شريحة مجهر زجاجية تحتوي على حلقة من الشحوم المفرغة مملوءة بنفس E3-tricaine-PTU.
8. معالجة الصور المكتسبة باستخدام حزم برامج تحليل الصور المجانية مثل NIH Image J / FIJI.
   ملاحظه: عد أرقام الخلايا وحدد الديناميكيات مثل ترحيل الخلايا وانقسام الخلايا باستخدام خوارزميات التجزئة والتتبع.

Materials