بضع الأكسونات بالليزر ثنائي الفوتون: طريقة لإصابة المحاور في أجنة أسماك الزرد ومراقبة الانتعاش المحوري

الملخص

المصدر: O'Brien G. S., et al. بضع البؤر ثنائي الفوتون والتصوير متحد البؤر بفاصل زمني في أجنة أسماك الزرد الحية. J. Vis. Exp. (2009).

يصف هذا الفيديو طريقة إصابة المحاور في أجنة أسماك الزرد باستخدام بضع المحوريات بالليزر الفوتون ومراقبة الشفاء المحوري من الإصابة.

البروتوكول

فئة

1: بضع المحور ثنائي الفوتون باستخدام مجهر ثنائي الفوتون مصمم خصيصا مع ليزر Chameleon Ti-Sapphire

1. استعد للتصوير. ضع الأجنة (الأجنين) المركبة على حامل منزلق تحت المجهر. ركز على جنين واحد مع هدف مائي 40X (0.8 NA). قم بتشغيل الليزر. لقد تمكنا من تصور الخلايا العصبية التي تعبر عن GFP وإتلافها بشكل متكرر باستخدام المعلمات التالية. لتصور المحاور بقوة غير ضارة ، اضبط الليزر على طول موجي 910 نانومتر (نانومتر) وقوة 30 مللي واط (ميغاواط المدرجة هي مقدار الطاقة في العينة). افتح برنامج التصوير. نحن نستخدم برنامج ScanImage الذي تم تطويره في مختبر Karel Svoboda.
2. اضغط على التركيز لمسح الجنين باستخدام ليزر ثنائي الفوتون ، وحدد موقع المحور العصبي الذي ترغب في إفصاله ، والتقط صورة لهذا المحور العصبي. حدد موضعي Z الأول والأخير ، واحصل على الصورة ، وقم بإجراء أقصى عرض لمكدسات Z.
3. قم بتكبير 70X على فرع المحور العصبي الذي ترغب في إقصاصه وإيقاف المسح. قم بزيادة mW في العينة إلى الطاقة الضارة البالغة 180 ميجاوات ، وقم بإجراء مسح واحد بالليزر. نقوم بذلك عن طريق ضبط عدد شرائح Z على 1 والضغط على "Grab". يجب أن يكون هذا كافيا لقطع المحور العصبي. راجع المناقشة لمعرفة طرق تحسين هذا الإجراء للمجهر والهدف التجريبي.
4. قم بالتصغير ، وتقليل الطاقة إلى 30 ميجاوات والتقط صورة.

فئة

2: بضع المحورين الفوتونيين على مجهر Zeiss 510 / ثنائي الفوتون

1. ضع الجنين المركب على المسرح وقم بالتركيز عليه باستخدام هدف مائي 25X أو هدف مناسب آخر.
2. قم بتشغيل ليزر الفوتون ثنائي الفوتون (910 نانومتر) والأرجون (488 نانومتر) في إعداد متعدد المسارات بحيث يمكن التبديل من واحد إلى آخر. على الرغم من استخدام كلا الليزرن للكشف عن GFP ، إلا أن انبعاث الفوتونين يتم تصوره باللون الأحمر ، وانبعاث ليزر الأرجون باللون الأخضر للتمييز بين الاثنين.
3. استخدم ليزر الأرجون لتحديد المحور العصبي المراد إصابته. ضمن إعدادات Z ، ضع علامة على القسمين البصري الأول والأخير. التقط صورة متحدة البؤر وأنشئ أقصى إسقاط لمكدس Z.
4. اختر منطقة المحور العصبي المراد إصابته والتركيز على هذه المنطقة. قم بإيقاف تشغيل ليزر الأرجون وتشغيل ليزر ثنائي الفوتون. امسح العينة ضوئيا باستخدام الفوتون الثنائي بكثافة ليزر ~ 9٪ من الإرسال للتأكد من أن المحور العصبي لا يزال في بؤرة التركيز.
5. انقر فوق الزر "إيقاف" حتى تتوفر أداة الاقتصاص. استخدم الاقتصاص لتكبير منطقة الاهتمام. عادة ما نقوم بالتكبير إلى ~ 70X (يمكن التحقق من التكبير ضمن علامة التبويب "الوضع"). تحت علامة التبويب "القنوات" ، قم بتغيير شدة الفوتونين من ~ 9٪ إلى 15-20٪ إرسال.
6. لقطع محور عصبي ، قم بتنشيط زر "XY السريع" لمدة ثانية واحدة تقريبا ثم اضغط على زر الإيقاف لتجنب التلف الزائد. يجب أن ينظر إلى المحور العصبي على أنه حطام متناثر إذا نجح الإجراء.
7. للتأكد من تلف المحور العصبي، عد إلى ليزر الأرجون 488 نانومتر، والتقط صورة متحدة البؤر أخرى، وأنشئ أقصى إسقاط.