علم البصريات الوراثي لسمك الزرد: تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية المعدلة وراثيا لدراسة الاستجابات السلوكية لليرقات

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Palanca A.M.S.، وآخرون. التنشيط البصري الوراثي للخلايا العصبية الحسية الجسدية لأسماك الزرد باستخدام ChEF-tdTomato. J. Vis. Exp. (2013).

يصف هذا الفيديو تقنيات البصريات الوراثية عن طريق تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية المعدلة وراثيا وتسجيل الاستجابة السلوكية المستحثة باستخدام كاميرا فيديو عالية السرعة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. جبل اليرقات للتجارب السلوكية

اصنع 1.5٪ من الاغاروز ذوبان منخفض في ddH2O واحفظه في كتلة حرارية 42 درجة مئوية لمنعه من التصلب.
باستخدام ماصة باستور زجاجية ، انقل إحدى اليرقات التي تم فحصها مسبقا إلى أنبوب من الاغاروز منخفض الذوبان بنسبة 1.5٪ مع أقل قدر ممكن من الماء الأزرق / الجنين.
انقل اليرقات في قطرة من الاغاروز إلى طبق بتري صغير.
تحت مجهر تشريح ، ضع اليرقة الظهرية لأعلى.
عندما يتجمد الاغاروز ، اقطع الاغاروز بشفرة حلاقة رفيعة (# 11 مشرط) ، تاركا إسفينا من الأجار حول اليرقة بأكملها.
قم بعمل قطعتين قطريتين على جانبي الصفار ؛ احرص على عدم تقطيع اليرقة.
املأ المنطقة المحيطة بالأغاروز بالماء الجنيني / الأزرق.
اسحب الاغاروز بعيدا عن جذع وذيل اليرقة (الشكل 1).

< ص الفئة = "jove_title" >2. إعداد الكاميرا عالية السرعة وبرامج التصوير

قم بتركيب كاميرا عالية السرعة على نطاق التشريح.
قم بتوصيل الكاميرا بالكمبيوتر.
قم بتشغيل الكمبيوتر.
قم بتشغيل الكاميرا عالية السرعة.
افتح برنامج الفيديو / التصوير (نستخدم برنامج التصوير AOS وسنصف إجراءات استخدامه هنا ، لكن برامج التصوير الأخرى مقبولة بنفس القدر).
اضبط إعدادات الكاميرا وفقا لذلك (أي 1,000 إطار في الثانية (fps) أو 50٪ من المخزن المؤقت للتشغيل أو الإعدادات المفضلة الأخرى).
ابدأ التسجيل.

فئة

3. تنشيط الخلايا العصبية المفردة باستخدام ليزر 473 نانومتر

قم بتوصيل المحفز والليزر والكابلات البصرية.
قم بتشغيل المحفز.
اضبط المحفز على 5 فولت كحد أقصى ومدة نبضة 5 مللي ثانية.
قم بتشغيل الليزر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
استخدم مجهر تشريح لوضع طرف الكبل البصري بالقرب من جسم الخلية العصبية مع تعبير ChEF-tdTomato (الشكل 1).
توصيل نبضة الضوء الأزرق لتنشيط الخلايا العصبية الحسية.
سجل السلوك باستخدام كاميرا عالية السرعة تم ضبطها على 500 أو 1,000 إطار في الثانية.
كرر التجربة حسب الرغبة ، وانتظر دقيقة واحدة بين كل تنشيط لتجنب التعود. (نسجل ما لا يقل عن ثلاث استجابات لكل خلية عصبية).
لإطلاق اليرقات ، قم بتفتيت الاغاروز بالملقط ، مع الحرص على عدم إصابة. يمكن السماح لهذا بالتطور بشكل أكبر ويمكن تكرار الإجراء في مرحلة أقدم لتوصيف تطور السلوك. يمكن أيضا إعادة تركيب الجنين للتصوير متحد البؤر عالي الدقة للخلية المنشطة لربط السلوك بالبنية الخلوية ، كما هو موضح أدناه.
انقل اليرقة إلى طبق الاستزراع بالماء الأزرق / الجنيني العذب. نستخدم صفيحة 24 بئرا لتتبع اليرقات الفردية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1. رسم تخطيطي ليرقة الزرد المركبة والخلايا العصبية التمثيلية المشاركة في استجابة لمس اليرقات. تم تركيب يرقات الزرد جزئيا في 1.5٪ من الاغاروز منخفض الذوبان (ممثلة بخطوط متقطعة تحيط بالجزء المنقاري من اليرقة). تم تصوير خلية عصبية ثلاثية التوائم (في الرأس) وخلية عصبية Rohon-Beard (في الجذع) باللون الأحمر. يتم تحديد خلايا Mauthner بخطوط متقطعة في اليرقة. يظهر الكبل البصري (الأبيض) موضوعا فوق جسم الخلية العصبية RB.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات منخفض الذوبان agarose سيغما أ 9045 أو ما يعادلها طبق بتري (100 × 15 مم) أي أي شفرات مشرط غير معقمة الأدوات العلمية الجميلة ، وشركة 10011-00 أو ما يعادلها ماء أزرق / جنين 10 لتر ddH2O 0.6 جم محيط سريع التحضير 6 قطرات من الميثيلين الأزرق كاميرا عالية السرعة شركة AOS Technologies، Inc. إكس بي آر آي (130025-10) أو ما يعادلها ماصة زجاجية باستور صياد 1367820 ب أو ما يعادلها (قطر 10-15 مم) 473 نانومتر ليزر محمول ليزر كريستال CL-473-050 أو طاقة أعلى ، مع خيار TTL محفز S48 Astro-Med، Inc. قسم الأدوات العشبية S48K أو ما يعادلها التريكايين سيغما أ 5040 200 ميكرومتر الألياف البصرية ثورلاب AFS200 / 220Y-مخصص سلك التصحيح ، الطول: 3 م ، النهاية A: FC / PC ، النهاية B: FC / PC ، السترة: FT030 50 ميكرومتر الألياف البصرية ثورلاب AFS50 / 125Y-مخصص سلك التصحيح ، الطول: 3 م ، النهاية A: FC / PC ، النهاية B: FC / PC ، السترة: FT030 24 لوحة ثقافة جينيسي 25-102 أو ما يعادلها

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

علم البصريات الوراثي لسمك الزرد: تنشيط الخلايا العصبية الحسية الجسدية المعدلة وراثيا لدراسة الاستجابات السلوكية لليرقات

في هذه المقالة

الملخص

البروتوكول

النتائج

المواد

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة