$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1
. تسجيل مشبك التصحيح (وضع الخلية الكاملة)
- يتم تنفيذ جميع التسجيلات في وضع مشبك تصحيح الخلية بالكامل. يتم وضع غرف التسجيل على مرحلة المجهر في إعداد الفيزيولوجيا الكهربية. يتم إصلاح مراحلنا ويتم تثبيت مجهر مشبك التصحيح المستقيم بمنصة مجهر متحركة أو مترجم مجهر.
- يتم سحب ماصات مشبك التصحيح على مجتذب أفقي (P-97; شركة سوتر للأدوات من زجاج البورسليكات رقيق الجدران الذي تم الحصول عليه من WPI. تتراوح أقطار طرف الماصة من 0.2 إلى 0.4 ميكرومتر بعد تلميع الحريق إلى حافة ناعمة ، ويبلغ طول تفتق الساق ~ 4 مم.
- قم بتوصيل الماصة بمرحلة رأس مكبر الصوت في إعداد الفيزيولوجيا الكهربية. من المهم الحفاظ على مرحلة الرأس بزاوية 45 درجة تقريبا للمحور الأفقي لأن هذا يضمن زاوية دخول الماصة المناسبة لتشكيل موانع تسرب عالية المقاومة على خلية Mauthner.
- قبل دخول محلول الحمام مباشرة ، قم بتطبيق كمية صغيرة من الضغط الإيجابي على الماصة لتقليل فرصة اتساخ الطرف. عند تسجيل mEPSCs ، تشتمل حلول الحمام على 1 ميكرومتر TTX لمنع إمكانات العمل ، و 5 ميكرومتر من الإستركنين لمنع مستقبلات الجلايسين و 10 ميكرومتر بيكوكولين أو 100 ميكرومتر بيكروتوكسين لمنع مستقبلات GABAA. عند تسجيل mIPSCs ، تشمل محاليل الحمام 1 ميكرومتر TTX وحمض الكينورينيك وإما بيكوكولين أو الإستركنين اعتمادا على نشاط المستقبلات المعنية.
- اقترب من الخلية M بكمية صغيرة من الضغط الإيجابي في الماصة. يدفع الضغط الإيجابي الخلية برفق من جانب إلى آخر وعندما يتم وضعه مباشرة فوق الخلية ، يشكل غمازة صغيرة على غشاء الخلية. اترك الماصة في مكانها لبضع ثوان لتنظيف سطح الخلية برفق بحيث يمكن تكوين مانع تسرب قوي بين الماصة والغشاء. يسمح إطلاق الضغط الإيجابي في الماصة ببدء الختم وتؤدي كمية صغيرة من الضغط السلبي إلى جانب إمكانات الماصة السالبة إلى تكوين سدادات GigaΩ في غضون ثوان قليلة.
- قم بتغيير إمكانات الاحتفاظ بمكبر الصوت إلى -60 مللي فولت. تمزق غشاء الخلية بسلسلة من نبضات الشفط القصيرة. سجل إمكانات الغشاء على الفور وقلل من القطع الأثرية للسعة. تعويض سعة الخلية (سم) ومقاومة الوصول (السلسلة) (Ra) بنسبة 70-85٪. يجب مراقبة Ra بشكل روتيني ، كل 30 ثانية إلى دقيقة ، وإذا كان هناك تغيير بنسبة 20٪ أو أكثر ، فقم بإجهاض التجربة.
- بمجرد انتهاء التجربة والحصول على بيانات كافية ، يتم التضحية بالتحضير عن طريق إزالة الدماغ الخلفي باستخدام زوج من الملقط. في هذه المرحلة ، يمكن أن يبدأ تحليل البيانات.