الحقن العضلي (IM): توصيل مركب إلى العضلات الظهرية لأسماك الزرد البالغة

الملخص

المصدر: Myllymäki, H., et al. تحصين أسماك الزرد البالغة للفحص قبل السريري للقاحات القائمة على الحمض النووي. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو تقنية الحقن العضلي لتوصيل المركبات إلى العضلات الظهرية لأسماك الزرد البالغة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. حقن لقاح الحمض النووي والتثقيب الكهربائي

1. للتطعيمات وفقا لهذا البروتوكول ، استخدم أسماك الزرد البالغة الصحية التي تتراوح أعمارها بين 6 و 12 شهرا. احتفظ بالأسماك في نظام تدفق مع دورة إضاءة / ظلام مدتها 14/10 ساعات ، بحد أقصى سبع أسماك لكل 1 لتر من الماء.
2. قم بإعداد محلول إستر إيثيل (ثلاثي الأبعاد 3-aminobenzoic) بنسبة 0.02٪ (درجة الحموضة 7) في مياه الخزان لتخدير الأسماك. استخدم طبق بتري مقاس 10 سم أو شيء مشابه.
3. قم بإعداد خزان استرداد عن طريق ملء دورق سعة 5 لتر ب 3 لتر من مياه النظام النظيفة.
4. قم بإعداد حشوة التطعيم لإبقاء الأسماك في وضع ثابت أثناء التطعيم. خذ قطعة 5 × 7 سم² من إسفنجة بسمك 2 إلى 3 سم. قطع أخدود في الإسفنجة بشفرة مشرط أو مقص حاد.
   ملاحظه: يمكن استخدام نفس حشوة التطعيم في تجارب متعددة. تطهير الإسفنجة بين التجارب عن طريق نقعها في 70٪ كحول إيثيلي واتركها حتى تجف.
5. انقع الإسفنجة جيدا في ماء النظام وضع الإسفنجة على طبق بتري.
6. صيام السمك قبل 24 ساعة من التطعيمات.
7. قم بتخدير سمكة زرد واحدة عن طريق وضعها على طبق بتري يحتوي على 0.02٪ ثلاثي الكنائين. انتظر حتى لا تستجيب الأسماك لتحفيز اللمس وحتى لا تكون هناك حركة للخياشيم. تخدير سمكة واحدة في كل مرة.
8. باستخدام ملعقة بلاستيكية ، انقل سمكة الزرد المخدرة إلى الإسفنجة المبللة واضع الجانب البطني للسمكة لأسفل في الأخدود. في الموضع الصحيح ، تأكد من أن رأس ومعظم جسم السمكة داخل الأخدود وأن الزعنفة الظهرية والذيل بارزان من الأخدود.
9. تحت المجهر ، ضع الإبرة بعناية بزاوية 45 درجة تقريبا بالقرب من العضلة الظهرية لسمك الزرد ، باستخدام عجلات الضبط الدقيق للمحورين x و y على المعالج الدقيق.
10. ابحث عن البقعة الصغيرة بدون قشور أمام الزعنفة الظهرية ، حيث لا يتطلب دفع الإبرة القوة. إذا شعرت بالمقاومة ، فجرب مكانا مجاورا. تجنب إصابة العمود الفقري أو الزعنفة الظهرية أو القشور.
    ملاحظه: إذا انحنت الإبرة أثناء الدفع ، فقم بتقصير الإبرة قليلا عن طريق قطعها.
11. استخدم مفتاح القدم لحقن محلول اللقاح تدريجيا في العضلات. راقب الحقن من خلال المجهر: يظهر الفينول الأحمر عند دخوله الأنسجة العضلية. اضبط مدة النبضة إذا لزم الأمر.
    ملاحظه: بدلا من ذلك ، استخدم زر بادئ النبض على اللوحة الأمامية للمضخة الهوائية للحقن. ومع ذلك ، فإن استخدام مفتاح القدم عن بعد يسمح باستخدام اليد الأخرى لضبط طول النبضة بواسطة عجلة الاتصال الهاتفية ذات 10 أدوار. تجنب حقن المحلول بسرعة كبيرة ، لأن هذا قد يتسبب في تلف الأنسجة بشكل مفرط. تأكد من عدم حقن أي هواء.
12. قم بالكهرباء للأسماك مباشرة بعد الحقن. تأكد من أن السمكة لا تزال تحت التخدير. احتفظ بالسمك على الإسفنجة واضبط السمكة بين أقطاب كهربائية من نوع الملقط ، بحيث توجد الأقطاب الكهربائية على كل جانب من موقع الحقن. لا تضغط على ملاقط القطب بإحكام شديد ولكن احتفظ بكلا القطبين على اتصال بالأسماك.
    1. اضغط على زر البدء الموجود على المثقب الكهربائي لإعطاء ست نبضات 40 فولت و 50 مللي ثانية.
    2. انقل السمكة برفق إلى خزان الاسترداد.
    3. قم بتنظيف الأقطاب الكهربائية بعد كل تثقيب كهربائي عن طريق تمريرها بنسبة 70٪ من الإيثانول.
       ملاحظه: راقب بعناية رفاهية الأسماك بعد التطعيم. القتل الرحيم لأي سمكة تظهر عليها علامات الانزعاج (الشفاء البطيء من التخدير ، السباحة الشاذة ، اللهاث) في 0.04٪ ثلاثي اللقب. بعد التعافي ، انقل الأسماك إلى وحدة التدفق وإطعامها بشكل طبيعي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ملح الصوديوم الأحمر الفينول سيجما ألدريتش هاتف 114537-5 جيجا التريكايين (ملح إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات) سيغما أ 5040-100 جرام محلول التخدير والقتل الرحيم أطقم أقطاب الملقط (7 مم) جهاز BTX هارفارد BTX 450165 أقطاب كهربائية من نوع الملقط الشعيرات الدموية سيليكات الألومنيوم جهاز هارفارد 30-0108 معالج دقيق ناريشيجي إم إيه -153 مجهر أوليمبوس ZS61 ECM الكهربائية مربع بوراتور جهاز BTX هارفارد BTX ECM 830 ملعقة بلاستيكية إسفنج منضدة الستايروفوم