المصدر: Sorlien, E.L., et al. الإنتاج الفعال وتحديد الضربات القاضية الجينية التي تم إنشاؤها بواسطة CRISPR / Cas9 في نظام النموذج Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).
يصف هذا الفيديو تقنية الحقن المجهري للأجنة لتوصيل المركبات إلى كيس صفار الزرد.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الحقن المجهري للأجنة: تقنية لتوصيل مركب إلى صفار الزرد
4.1K مشاهدة
⸱
أبريل 30, 2023
في هذه المقالة
الملخص
البروتوكول
فئة
1. الحقن المجهري لمكونات CRISPR في أجنة أسماك الزرد
- قم بإعداد خزانات التكاثر في الليلة السابقة للحقن عن طريق وضع عدد الذكور والإناث المطلوبين (عادة 2 أنثى و 1 أو 2 ذكر) في خزان تربية مع وجود مقسم في مكانه.
- قم بإعداد لوحة حقن دقيق مع 1.5٪ agarose في وسائط 1x E3 (انظر جدول المواد) مع 0.01٪ ميثيلين أزرق (مبيد للفطريات) عن طريق صب 35 مل من الاغاروز المذاب في طبق بتري مقاس 10 سم ووضع قالب بلاستيكي برفق لإنشاء أحواض على شكل إسفين في المحلول ، والنقر على القالب للتخلص من فقاعات الهواء.
- اترك الاغاروز يتماسك ، وقم بتخزين الطبق بكمية صغيرة من الوسائط ولفه بغشاء البارافين لمنع الطبق من الجفاف عند 4 درجات مئوية.
مل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 1: مقارنة صحة 24 أجنة محقونة بدرجة حرارة الحفل. يمكن تمييز الجنين الحي (A) الذي تم تطويره إلى 24 hpf بسهولة عن الجنين الذي أجهض النمو (B). يجب إزالة الأجنة التي تشبه (ب) أو التي تغيرت سماتها بشكل جذري إلى (أ) ، مثل انحناء العمود الفقري أو تغير نمو الرأس والعين من الطبق
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم
الشركة
رقم فهرسي
التعليقات
مياه خالية من RNase
أي علامة تجارية
توليف دليل الحمض النووي الريبي. حراري
فيشر وكياجين كلاهما يحمل
ماء مناسب. وسائط الجنين E3 صنع في المنزل وسائل الإعلام لتربية الأجنة و
صنع لوحة Injeciton.
الوصفة: محتوى http://cshprotocols.cshlp.org/ / 2011/10 / pdb.rec66449 الميثيلين الأزرق سيجما ألدريتش M9140 يضاف إلى 1x E3 الوسائط لمنع نمو الفطريات على الأجنة. طبق بتري ثيرمو فيشر FB0875711Z تخزين الأجنة ، لوحة الحقن المصبوب أغاروز دينفيل CA3510-8 لوحة حقن الصب ، المواد الهلامية الاغاروز. قالب Microinection أدوات العلوم التكيفية TU-1 لإنشاء آبار لحمل الأجنة أثناء الحقن الفينول الأحمر سيجما ألدريتش P0290 صبغة لتصور الحقن الزيوت المعدنية سيجما ألدريتش M5904-5ML لمعايرة حجم حقن الإبرة. نقل الماصات أي علامة تجارية نقل الأجنة شفرة الحلاقة ثيرمو فيشر 11295-10 قطع إبرة حقن ، ذيل قص الأسماك البالغة. حاضنه الحفاظ على الأجنة عند 28.5 درجة مئوية. مجتذب الماصة العمودي ديفيد كوبف انسترومنتسمنتس 700 درجة مئوية توليد الإبر للحقن. تعليمات إضافية لسحب الإبرة:
محتوى http:// cshprotocols.cshlp.org/ / 2006/7 / pdb.prot4651.long أنابيب شعرية أدوات سوتر BF100-58-10 توليد الإبر للحقن. نصائح Microloader إيبندورف 930001007 تحميل المحلول في إبر الحقن حاقن دقيق أدوات الدقة العالمية الكهروضوئية 820 حقن الأجنة. مجهر مفكك لايكا حقن الأجنة. المايكرويف أي علامة تجارية لوحة حقن الصب ، المواد الهلامية الاغاروز. مِيزَان أي علامة تجارية لوحة حقن الصب ، المواد الهلامية الاغاروز. القفازات أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. N2 أي علامة تجارية لطرد السائل من الشعيرات الدموية لحقن الأجنة أنابيب شريط PCR أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. أطراف 200 ميكرولتر أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. أطراف 10 ميكرولتر أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. الماصات الدقيقة أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول.
فيشر وكياجين كلاهما يحمل
ماء مناسب. وسائط الجنين E3 صنع في المنزل وسائل الإعلام لتربية الأجنة و
صنع لوحة Injeciton.
الوصفة: محتوى http://cshprotocols.cshlp.org/ / 2011/10 / pdb.rec66449 الميثيلين الأزرق سيجما ألدريتش M9140 يضاف إلى 1x E3 الوسائط لمنع نمو الفطريات على الأجنة. طبق بتري ثيرمو فيشر FB0875711Z تخزين الأجنة ، لوحة الحقن المصبوب أغاروز دينفيل CA3510-8 لوحة حقن الصب ، المواد الهلامية الاغاروز. قالب Microinection أدوات العلوم التكيفية TU-1 لإنشاء آبار لحمل الأجنة أثناء الحقن الفينول الأحمر سيجما ألدريتش P0290 صبغة لتصور الحقن الزيوت المعدنية سيجما ألدريتش M5904-5ML لمعايرة حجم حقن الإبرة. نقل الماصات أي علامة تجارية نقل الأجنة شفرة الحلاقة ثيرمو فيشر 11295-10 قطع إبرة حقن ، ذيل قص الأسماك البالغة. حاضنه الحفاظ على الأجنة عند 28.5 درجة مئوية. مجتذب الماصة العمودي ديفيد كوبف انسترومنتسمنتس 700 درجة مئوية توليد الإبر للحقن. تعليمات إضافية لسحب الإبرة:
محتوى http:// cshprotocols.cshlp.org/ / 2006/7 / pdb.prot4651.long أنابيب شعرية أدوات سوتر BF100-58-10 توليد الإبر للحقن. نصائح Microloader إيبندورف 930001007 تحميل المحلول في إبر الحقن حاقن دقيق أدوات الدقة العالمية الكهروضوئية 820 حقن الأجنة. مجهر مفكك لايكا حقن الأجنة. المايكرويف أي علامة تجارية لوحة حقن الصب ، المواد الهلامية الاغاروز. مِيزَان أي علامة تجارية لوحة حقن الصب ، المواد الهلامية الاغاروز. القفازات أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. N2 أي علامة تجارية لطرد السائل من الشعيرات الدموية لحقن الأجنة أنابيب شريط PCR أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. أطراف 200 ميكرولتر أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. أطراف 10 ميكرولتر أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. الماصات الدقيقة أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول.
