الحقن المجهري للأجنة: تقنية لتوصيل مركب إلى صفار الزرد

الملخص

المصدر: Sorlien, E.L., et al. الإنتاج الفعال وتحديد الضربات القاضية الجينية التي تم إنشاؤها بواسطة CRISPR / Cas9 في نظام النموذج Danio rerio. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو تقنية الحقن المجهري للأجنة لتوصيل المركبات إلى كيس صفار الزرد.

البروتوكول

فئة

1. الحقن المجهري لمكونات CRISPR في أجنة أسماك الزرد

1. قم بإعداد خزانات التكاثر في الليلة السابقة للحقن عن طريق وضع عدد الذكور والإناث المطلوبين (عادة 2 أنثى و 1 أو 2 ذكر) في خزان تربية مع وجود مقسم في مكانه.
2. قم بإعداد لوحة حقن دقيق مع 1.5٪ agarose في وسائط 1x E3 (انظر جدول المواد) مع 0.01٪ ميثيلين أزرق (مبيد للفطريات) عن طريق صب 35 مل من الاغاروز المذاب في طبق بتري مقاس 10 سم ووضع قالب بلاستيكي برفق لإنشاء أحواض على شكل إسفين في المحلول ، والنقر على القالب للتخلص من فقاعات الهواء.
3. اترك الاغاروز يتماسك ، وقم بتخزين الطبق بكمية صغيرة من الوسائط ولفه بغشاء البارافين لمنع الطبق من الجفاف عند 4 درجات مئوية.
   ملاحظه: يمكن إعادة استخدام ألواح الحقن لعدة أسابيع ، حتى تصبح الآبار مشوهة أو جافة ، أو تبدأ اللوحة في نمو العفن.
4. في صباح يوم الحقن ، قم بإذابة الثلج من بروتين sgRNA و Cas9 المنقى على الجليد. تذكر التعامل مع جميع المواد بالقفازات لمنع تلوث RNase واستخدام أطراف وأنابيب خالية من RNase.
5. قم بإنشاء محلول حقن 5 ميكرولتر عن طريق الجمع بين بروتين Cas9 و sgRNA بنسبة 2: 1 من Cas9: sgRNA للحصول على تركيزات نهائية من 400 بيكوغرام / نانولتر من بروتين Cas9 و 200 بيكوغرام / لتر sgRNA. احتضان محلول Cas9 / sgRNA في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق للسماح ل Cas9 و sgRNA بتكوين مركب بروتين نووي الريبي. أضف 0.5 ميكرولتر من محلول أحمر الفينول بنسبة 2.5٪ بالوزن / الحجم (انظر جدول المواد) ، والماء الخالي من RNase إلى الحجم النهائي البالغ 5 ميكرولتر
   ملاحظه: لقد ثبت أن القوة الأيونية للمحلول تؤثر على قابلية ذوبان مركب Cas9 / sgRNA ، وبالتالي فإن إضافة KCl قد تزيد من كفاءة القطع ل sgRNAs التي تظهر تكوينا منخفضا للإنديل.
6. اصنع إبرة حقن عن طريق سحب شعيرات دموية زجاجية مقاس 1.0 مم باستخدام مجتذب ماصات دقيقة. قم بقص طرف الإبرة الطازجة باستخدام شفرة حلاقة جديدة أو ملقط للحصول على فتحة بزاوية تخترق بسهولة كيس المشيمة والصفار
7. ضع الإبرة في مناور دقيق متصل بحاقن دقيق مع تشغيل مصدر الهواء. تحت المجهر الضوئي باستخدام التكبير المناسب للمعايرة المحددة لجهاز معين ، اضبط ضغط الحقن حتى تخرج الإبرة باستمرار محلول 1 nL في طبق بتري مملوء بالزيوت المعدنية.
   ملاحظه: جودة الإبرة أمر بالغ الأهمية. تدرب على إنتاج إبرة والحقن في كيس صفار الأجنة حتى يتم إتقان هذه المهارة قبل محاولة المزيد من التجارب.
8. قم بإزالة الحاجز واترك الأسماك تتكاثر لمدة 15 دقيقة تقريبا.
   ملاحظه: ستنتج أوقات التكاثر الأطول المزيد من الأجنة ، ولكن يجب إكمال الحقن أثناء وجود الأجنة في مرحلة الخلية الواحدة لزيادة فرصة حدوث قطع Cas9 مبكرا وبالتالي تقليل الفسيفساء الجينية. يمكن حقن الأجنة في مراحل لاحقة (2-4 مراحل خلوية) ، ولكن هذا قد يقلل من معدل انتقال السلالة الجرثومية للأليل المعدل.
9. اجمع البيض باستخدام مصفاة واشطفه في طبق بتري مقاس 10 سم باستخدام وسائط 1x E3 مع 0.0001٪ أزرق ميثيلين. افحص صحة البويضات تحت المجهر الضوئي ، وقم بإزالة أي بويضات وحطام غير مخصب.
10. ضع جانبا 10-15 جنينا كعنصر تحكم غير محقون في طبق بتري منفصل يحمل علامة بتري.
11. باستخدام ماصة النقل ، قم بمحاذاة البيض برفق على لوحة الحقن الدافئة إلى درجة حرارة الغرفة.
12. تحت مجهر التشريح بتكبير 2.5X ، قم بحقن 1 نانولتر من المحلول في كيس صفار البيض لكل جنين لحقن ما مجموعه 400 بيكوغرام من بروتين Cas9 و 200 بيكوغرام من sgRNA.
    ملاحظه: لزيادة القطع إذا رغبت في ذلك أو لزم الأمر ، قم بزيادة التركيز النهائي لبروتين Cas9 إلى 800 بيكوغرام / نانولتر ومن sgRNA إلى 400 بيكوغرام / نيولتر في محلول الحقن ؛ ومع ذلك ، قد يؤدي هذا أيضا إلى زيادة القطع خارج الهدف و / أو تقليل صحة الجنين. يمكن أيضا زيادة كفاءة القطع عن طريق الحقن مباشرة في الخلية. ومع ذلك ، فإن الحقن في كيس الصفار أقل تطلبا من الناحية الفنية ويعطي قطعا كافيا لإنتاج الأسماك ذات انتقال السلالة الجرثومي المرتفع (>70٪ من النسل الذي يحتوي على أليل معدل).
13. أعد الأجنة المحقونة إلى طبق بتري المسمى بشكل صحيح ، وقم بتغطيتها بوسائط 1x E3 باللون الأزرق الميثيلين ، وضعها في حاضنة جنين مضبوطة على 28 درجة مئوية.
14. بعد 24 ساعة من الإخصاب (HPF) ، افحص صحة الأجنة المحقونة ، وإزالة الأفراد الميتين أو الذين يتطورون بشكل غير طبيعي وتغيير الوسائط (انظر الشكل 1). تحقق من معدل البقاء على قيد الحياة ضد التحكم غير المحقون.
    ملاحظه: عند استهداف جين غير أساسي ، من المتوقع أن تكون الفتك أقل من 10٪ بالنسبة للتحكم غير المحقون. إذا لوحظت مستويات مرتفعة من الفتك في المجموعات التي تم حقنها بالدليل مقارنة بالتحكم غير المحقون ، فقد يشير ذلك إلى أن الجين المستهدف ضروري للتطوير ، أو أن التأثيرات غير المستهدفة تؤدي إلى فشل التطور. قد يكون من الضروري تقليل كمية كواشف كريسبر المحقونة أو قد تكون هناك حاجة إلى توليد sgRNA جديد مع تقليل التأثيرات خارج الهدف.
15. أعد الأجنة إلى الحاضنة واستمر في نمو الأجنة إلى 72 حصانا ، وقم بتغيير الوسائط يوميا للحفاظ على صحة الجنين.

النتائج

الشكل 1: مقارنة صحة 24 أجنة محقونة بدرجة حرارة الحفل. يمكن تمييز الجنين الحي (A) الذي تم تطويره إلى 24 hpf بسهولة عن الجنين الذي أجهض النمو (B). يجب إزالة الأجنة التي تشبه (ب) أو التي تغيرت سماتها بشكل جذري إلى (أ) ، مثل انحناء العمود الفقري أو تغير نمو الرأس والعين من الطبق

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مياه خالية من RNase أي علامة تجارية توليف دليل الحمض النووي الريبي. حراري
فيشر وكياجين كلاهما يحمل
ماء مناسب. وسائط الجنين E3 صنع في المنزل وسائل الإعلام لتربية الأجنة و
صنع لوحة Injeciton.
الوصفة: محتوى http://cshprotocols.cshlp.org/ / 2011/10 / pdb.rec66449 الميثيلين الأزرق سيجما ألدريتش M9140 يضاف إلى 1x E3 الوسائط لمنع نمو الفطريات على الأجنة. طبق بتري ثيرمو فيشر FB0875711Z تخزين الأجنة ، لوحة الحقن المصبوب أغاروز دينفيل CA3510-8 لوحة حقن الصب ، المواد الهلامية الاغاروز. قالب Microinection أدوات العلوم التكيفية TU-1 لإنشاء آبار لحمل الأجنة أثناء الحقن الفينول الأحمر سيجما ألدريتش P0290 صبغة لتصور الحقن الزيوت المعدنية سيجما ألدريتش M5904-5ML لمعايرة حجم حقن الإبرة. نقل الماصات أي علامة تجارية نقل الأجنة شفرة الحلاقة ثيرمو فيشر 11295-10 قطع إبرة حقن ، ذيل قص الأسماك البالغة. حاضنه الحفاظ على الأجنة عند 28.5 درجة مئوية. مجتذب الماصة العمودي ديفيد كوبف انسترومنتسمنتس 700 درجة مئوية توليد الإبر للحقن. تعليمات إضافية لسحب الإبرة:
محتوى http:// cshprotocols.cshlp.org/ / 2006/7 / pdb.prot4651.long أنابيب شعرية أدوات سوتر BF100-58-10 توليد الإبر للحقن. نصائح Microloader إيبندورف 930001007 تحميل المحلول في إبر الحقن حاقن دقيق أدوات الدقة العالمية الكهروضوئية 820 حقن الأجنة. مجهر مفكك لايكا حقن الأجنة. المايكرويف أي علامة تجارية لوحة حقن الصب ، المواد الهلامية الاغاروز. مِيزَان أي علامة تجارية لوحة حقن الصب ، المواد الهلامية الاغاروز. القفازات أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. N2 أي علامة تجارية لطرد السائل من الشعيرات الدموية لحقن الأجنة أنابيب شريط PCR أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. أطراف 200 ميكرولتر أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. أطراف 10 ميكرولتر أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول. الماصات الدقيقة أي علامة تجارية لجميع جوانب البروتوكول.