حقن تقويم العظام: زرع خلايا سرطانية خاصة بالأنسجة في فأر بالغ

الملخص

المصدر: Katsuta, E., et al. توليد نموذج سرطان الثدي النقيلي لتقويم العظام الفئران وإجراء استئصال الثدي الجذري للفئران.J. Vis. Exp.(2018).

يوضح الفيديو تقنية التطعيم التقويمي لسرطان الثدي في نموذج الفأر. تنتج هذه التقنية معدل تكوين أورام مرتفعا مع تباين أقل في حجم الورم وشكله مقارنة بالحقن تحت الجلد أو غير الجراحي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الخلايا (ل 10 فئران)

ملاحظة: يجب تلقيح الخلايا في غضون ساعة واحدة بعد فصلها عن الطبق لتجنب انخفاض صلاحية الخلية. على وجه التحديد ، يجب خلط معلق الخلية في خليط البروتين الجيلاتيني في غضون 15 دقيقة بعد فصل الخلايا عن الطبق للحفاظ على صلاحيتها.

1. خلايا مزرعة 4T1-luc2 ، وهي خط خلية سرطان غدي ثديي للفأر يعبر عن لوسيفيراز ، في وسائط RPMI 1640 مع 10٪ FBS في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
2. اغسل الخلايا الملتصقة 4T1-luc2 في طبق بطول 10 سم باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. أضف 1 مل من 0.25٪ تريبسين باستخدام ماصة P1000 ، ثم احتضن العينة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد ذلك، أضف 4 مل من وسائط النمو (RPMI-1640 مع 10٪ FBS) باستخدام ماصة مصلية سعة 5 مل وانقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل في غطاء زراعة الأنسجة. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 180 × جم لمدة 5 دقائق.
3. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من PBS ؛ ثم قم بحساب الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
4. قم بتعليق 2 × 10⁶ خلايا 4T1-luc2 في 40 ميكرولتر من PBS البارد (درجة الحموضة 7.4 ، 4 درجات مئوية) في غطاء زراعة الأنسجة.
5. امزج معلق الخلية سعة 40 ميكرولتر مع 360 ميكرولتر من خليط البروتين الجيلاتيني في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل على الجليد في غطاء زراعة الأنسجة.
   ملاحظة: التركيز النهائي هو 1 × 10⁵/20 ميكرولتر (1: 9 PBS: خليط البروتين الجيلاتيني). بالنسبة لنموذج تقويم العظام (بدون استئصال الثدي) ، تم استخدام 1 × 10⁴/20 ميكرولتر من التركيز النهائي ، لتجنب الوصول إلى معايير القتل الرحيم (حجم الورم > 2 سم) في غضون أسبوعين.

فئة

2. تلقيح الخلايا السرطانية

1. ضع الفئران في غرفة تحريض التخدير مع 2-4٪ إيزوفلوران و 0.2 لتر / دقيقة تدفق الأكسجين حتى تتنفس الفئران بهدوء (2-3 دقائق).
2. أمسك الفأر وحقن 0.05 ملغم/كغ من البوبرينورفين في كتفه تحت الجلد.
3. تأكد من التخدير الكافي من خلال عدم وجود رد فعل على قرصة إصبع القدم. أدخل أنف الفأر في فتحة قناع الفأر ، مما يسمح بالتخدير الاستنشاقي مع 2-4٪ من الأيزوفلوران و 2 لتر / دقيقة تدفق الأكسجين المتصل بوحدة علبة الفحم.
4. كبح أطراف الفأر باستخدام شريط المختبر وتعقيم جلده باستخدام الكلورهيكسيدين واليود والإيثانول بنسبة 75٪ باستخدام مسحات قطنية.
5. قم بعمل شق جلدي 5 مم في منتصف جدار الصدر الأمامي باستخدام مقص التشريح المجهري المعقم ، وارفع الجلد الأيمن بجوار الشق وافصل الجلد عن جدار الصدر باستخدام المقص ، ثم اقلب الجلد لكشف وسادة الدهون الثديية اليمنى # 2.
6. حقن 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية بعناية باستخدام حقنة أنسولين سعة 1 مل بإبرة 28.5 جم في وسادة الدهون تحت الرؤية المباشرة من خلال الجرح><. ملاحظة: تمر الإبرة عبر الجرح وليس الجلد. استمر في إمساك الإبرة في وسادة الدهون لمدة 5 ثوان قبل سحبها للخارج ، مما يتيح وقتا لخليط البروتين الجيلاتيني للتصمد.
7. أغلق شقوق الجلد عن طريق الخياطة باستخدام خيوط معقمة 5-0 غير قابلة للامتصاص.
8. بعد الجراحة، أعد إلى قفص نظيف وراقبها حتى تتعافى وتتحرك بحرية (بعد ~ 1-2 دقيقة). إذا لم يبد بصحة جيدة خلال 24 ساعة من الجراحة، فقم بإعطاء البوبرينورفين (0.2 ملغم/كجم).
9. قم بإزالة الغرز تحت التخدير (انظر الخطوة 2.1) 7 د بعد الجراحة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مقص التشريح الجزئي روبوز RS-5983 لتلقيح الخلايا السرطانية واستئصال الثدي 5-0 خيوط حريرية رأى 774 ب فهرنهايت معهد روزويل بارك التذكاري 1640 جيبكو 11875093 لزراعة الخلايا مصل الأبقار الجنينية جيبكو 10437028 لزراعة الخلايا التربسين EDTA (0.25٪) جيبكو 25200056 لزراعة الخلايا معقم جاف (Germinator 500) برينتري العلمية جي إي آر 5287-120 فولت لتلقيح الخلايا السرطانية واستئصال الثدي حامل إبرة روبوز RS-7830 لتلقيح الخلايا السرطانية واستئصال الثدي ملقط Adson روبوز RS-5233 لتلقيح الخلايا السرطانية واستئصال الثدي المقص وال 9908-717 لتلقيح الخلايا السرطانية واستئصال الثدي ماتريجيل كورنينج 354234 لتلقيح الخلايا السرطانية