الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد مع التفاعل المباشر: الزراعة المشتركة للخلايا السرطانية مع الخلايا الوحيدة لدراسة تفاعلها

الملخص

المصدر: Espinoza-Sánchez ، وآخرون <a href = "https://www.jove.com/v/56589/analyzing-communication-between-monocytes-primary-breast-cancer-cells"> تحليل الاتصال بين الخلايا الوحيدة وخلايا سرطان الثدي الأولية في نظام ثلاثي الأبعاد قائم على مستخلص المصفوفة خارج الخلية (ECME). J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو الزراعة المشتركة ثلاثية الأبعاد لخلايا سرطان الثدي مع الخلايا الوحيدة لدراسة تفاعلها في بيئة قائمة على مستخلص المصفوفة خارج الخلية (ECME). تساعد هذه الطريقة في دراسة ميزات محددة مثل تدهور الكولاجين وتجنيد الخلايا المناعية وغزو الخلايا.

البروتوكول

1. 3D الثقافات المشتركة مع التفاعل المباشر

1. قم بتسمية خلايا BrC والخلايا الوحيدة بأصباغ فلورية مختلفة قبل زراعة الخلايا للسماح بالفرز المستقل لكل سلالة خلية بعد الزراعة لتحليل mRNA وتعبير البروتين. استخدم مشتقات الكومارين والرودامين المتوفرة تجاريا والتي تمر بحرية عبر غشاء الخلية للخلايا الحية. البروتوكول العام لوضع العلامات هو كما يلي:
   1. قم بإعداد طبقة أحادية من خلايا BrC ذات الأهمية (2 × 10⁶ خلايا في قارورة ثقافة 25 سم²) واستبدل الوسط القياسي بمحلول عمل كاف مسخن مسبقا لصبغة الفلورسنت (1: 2,000 من صبغة الفلورسنت في وسط القاعدة القياسية دون أي ملحق). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية_{في بيئة} رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون. قم بشفط محلول الصبغة واشطفه برفق باستخدام 1x PBS كاف. استنشق PBS وأضف الوسيط القياسي.
   2. قم بتربسين طبقة أحادية الخلية ب 2 مل من محلول 0.05٪ تريبسين و 0.48 ملي EDTA لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية. أضف 200 ميكرولتر من FBS لإيقاف التربسين و 7 مل من الوسط المقابل بدون مكملات. أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات. خذ مقاسة 10 ميكرولتر لحساب الخلايا في غرفة نيوباور. استمر في بروتوكول الزراعة المشتركة بعد عد الخلايا.
   3. قم بتكبيل الخلايا عند 430 × جم لمدة 5 دقائق في RT (قم بإجراء هذا أولا لأن الخلايا الوحيدة تنمو في التعليق). تخلص من المواد الطافية وأعد تعليق الخلايا برفق باستخدام 3 مل من محلول عمل مسخن مسبقا لصبغة الفلورسنت (1: 2,000 من صبغة الفلورسنت في وسط أساسي قياسي بدون مكملات). احتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
   4. قم بتقطيع الخلايا مرة أخرى ، وتخلص من محلول عمل الصبغة ، وأعد تعليقها برفق باستخدام 5-7 مل من 1x PBS. بيليه مرة أخرى ، وتخلص من PBS ، وأعد تعليق الخلايا في 5-7 مل من الوسط القياسي. خذ حصة من 10 ميكرولتر من تعليق الخلية لحساب الخلايا في غرفة نيوباور. استمر في بروتوكول الزراعة المشتركة بعد عد الخلايا.
2. اضبط الثقافة المشتركة على النحو التالي: انشر ما يكفي من ECME في قاع البئر لتشكيل طبقة متساوية في كل بئر من نظام انزلاق الغرفة المكون من 4 آبار. صفيحة 20 ميكرولتر من معلق خلية واحدة تحتوي على 5 × 10⁵ خلايا BrC مسماة لكل بئر.
3. بعد 15-20 دقيقة من الحضانة عند 37 درجة مئوية ، أضف تعليقا من 2.5 × 10⁵ خلايا وحيدة مصنفة في وسط فحص 80 ميكرولتر (مكمل بنسبة 60٪ ECME).
4. اسمح ل ECME بالتصلب لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
5. أضف 1 مل من مزيج 1: 1 من خلايا BrC ووسائط زراعة الخلايا الوحيدة.
6. احتضان المزارع المشتركة عند 37 درجة مئوية في بيئة رطبة بنسبة₅٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة أو 48 ساعة أو 5 أيام لتتبع التغييرات في نقاط زمنية مختلفة.
7. تحلل بروتينات ECM لاستعادة الخلايا من الثقافات. قم بالشفط والتخلص من الوسط ، وأضف 0.5 مل من 1x PBS مع 0.1٪ تربسين و 0.25٪ EDTA ، واحتضن لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية. بعد الحضانة ، أضف 0.5 مل من 1x PBS مع 10٪ FBS لتحييد التربسين ، وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات بقوة للحصول على تعليق أحادي الخلية.
8. خلايا الحبيبات عند 765 × جم لمدة 5 دقائق في RT ، وتخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 5 مل من 1x PBS مع 10٪ FBS. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
9. إخضاع تعليق الخلية لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) باستخدام الأداة المناسبة. تأكد من أن المجموعات النهائية نقية بنسبة 95٪ على الأقل).
10. بعد الفرز ، اغسل الخلايا بمعقم 1x PBS ، بيليه (430 × جم لمدة 5 دقائق في RT) ، وأعد تعليقه في 1x PBS معقم. يمكن معالجة الخلايا وفقا لبروتوكولات محددة لعزل الحمض النووي الريبي أو تحليل البروتين.
11. كرر كل اختبار ثلاث مرات ، بما في ذلك الثقافات ثلاثية الأبعاد لكل سلالة خلية فردية كضوابط.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات [أو937] مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC علامة الإدارة-1593.2 خط الخلايا أحادية الخلية / سرطان الغدد الليمفاوية النسيجي THP-1 مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC TIB-202 خط الخلايا أحادي الخلية / ابيضاض الدم أحادي الخلية الحاد MCF-10A مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC معيار التأهيل الهاتفي - 10317 خط خلايا الثدي غير المتحولة MCF-7 مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC إتش تي بي-22 خط خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231 مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC إتش تي بي-26 خط خلايا سرطان الثدي RPMI 1640 متوسط جيبكو BRL Life Technologies 11875-093 DMEM / F12 جيبكو BRL Life Technologies 11039-021 مضاد حيوي / مضاد للفطريات جيبكو BRL Life Technologies هاتف: 15240-062 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، و 0.25 ميكروغرام / مل Fungizone مصل الأبقار الجنينية جيبكو BRL Life Technologies 16000-044 مصل الحصان جيبكو BRL Life Technologies 16050114 0.05٪ تريبسين EDTA 1X جيبكو BRL Life Technologies هاتف: 25300-062 PBS 1X (محلول ملحي مخزن بالفوسفات جيبكو BRL Life Technologies 20012-027 عامل نمو البشرة (EGF) بيبروتك AF-100-15 (1.00 مجم) إنسولين سيجما ألدريتش I1882-100 ملغ الهيدروكورتيزون سيجما ألدريتش H088-5G سم الكوليرا الضمة الكوليرا سيجما ألدريتش سي 8052-1 ملغ ماتريجيل شركة كورنينج 356237 ساركوما الفأر Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) ، مستخلص المصفوفة خارج الخلية ، يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى الاستخدام عند 4 درجات مئوية شريحة غرفة Lab-Tek مع غطاء (8 بئر) نالجي نونك الدولية 177402