zPDX-تحليل الغزو: التحقيق في السلوك الغازي للخلايا السرطانية النقيلية في الطعوم الغريبة لجنين أسماك الزرد

الملخص

المصدر: Ren، J. et al. السلوك الغازي لخلايا سرطان الثدي البشرية في أسماك الزرد الجنينية. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو طريقة حقن مجهرية لتوصيل خلايا سرطان الثدي إلى الفضاء المحيط الزجاجي لأجنة الزرد المعدلة وراثيا. بعد الحضانة ، نتخيل الجنين تحت المجهر الفلوري لمراقبة غزو الخلايا السرطانية وانتشارها ورم خبيث.

البروتوكول

1. تصوير وتحليل العملية النقيلية

1. اجمع العديد من الأجنة المخدرة باستخدام ماصة باستور عريضة الرأس وانقلها إلى القاع الزجاجي لطبق البوليسترين.
2. قم بإزالة الماء الزائد واحتفظ بكمية محدودة من ماء البيض. قم بمعالجة الجنين في موضعه باستخدام أداة حلقة الشعر وضع غطاء فوق الزجاج.
3. استخدم مجهر متحد البؤر المقلوب مع الغمر في الماء أو الأهداف الجافة لمسافات طويلة. ضع الجنين بحيث تكون منطقة الاهتمام قريبة من الهدف قدر الإمكان.
4. إجراء التصوير مباشرة بعد التخدير لتقليل خطر الوفاة بسبب تبخر السائل.
   1. التقط الإشارات من الأوعية الدموية المسماة ب EGFP والخلايا السرطانية المسماة mCherry في نفس الموضع على الأجنة لتسجيل الخلايا المحقونة بالأوعية الدموية عن طريق دمج قناتي التصوير.
   2. لكل جنين من جنين الزرد ، اجمع مجموعتين مختلفتين من الصور من منطقة الرأس ومنطقة الذيل.
5. تحديد عدد الخلايا المنتشرة.
   1. بالنسبة لحقن الفضاء المحيطي ، احسب عدد الخلايا في كل سمكة التي انتشرت من كتلة الخلية باتجاه جسم السمكة الجنينية داخل مناطق الرأس والذيل 4،15 ؛ المناطق خارج حدود تجويف القلب أماميا ، أعلى مثانة السباحة ظهريا ، وخارج فتحة الجهاز البولي التناسلي ذيليا.
   2. بالنسبة لحقن Doc ، احسب عدد الخلايا الفردية التي غزت ألياف الكولاجين في الذيل من الدورة الدموية (MDA-MB-231) أو عدد المجموعات التي تشكلها الخلايا بشكل جماعي (M2) في الأنسجة الذيلية المكونة للدم (CHT) لكل سمكة زرد19.
6. دراسة الغزو والورم الخبيث بمزيد من التفصيل باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر (موصى به بشدة).
   1. استخدم التكبير المنخفض (هدف 4X) لتصوير الجسم كله والحصول على نظرة عامة على نمط انتشار الخلايا السرطانية.
      ملاحظة: التكبير العالي (أهداف 20X و 40X) مناسب لدراسة تكوين الأوعية داخل الورم ومحيطه والتوطين الدقيق للخلايا المنتشرة في جسم الجنين.
   2. استخدم ليزر 488 نانومتر لمسح الأوعية الدموية لجنين الزرد وليزر 543 نانومتر لمسح الخلايا السرطانية المزروعة المسماة بالفلورة الحمراء. احصل على صورة عالية الجودة عن طريق مسح كل جنين ضوئيا في ثماني إلى عشر خطوات. مسح وحساب كل خطوة ست مرات.
7. ضع الجنين بحذر مرة أخرى في ماء البويضة إذا كان ذلك ضروريا لمزيد من التجارب.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ماصة باستور عريضة الرأس (0.5-20 ميكرولتر) إيبندورف F276456I مجهر متحد البؤر لايكا SP5 ستيد مجهر ستيريو لايكا MZ16FA سلالة سمك الزرد Tg (fli: EGFP) تفضل بتقديم الدكتورة إيوا سنار جاغالسكا (معهد الأحياء ، جامعة ليدن ، ليدن ، هولندا) طبق البوليسترين مع قاع زجاجي ويلكو جي دبليو ست -5040 مجهر ستيريو فلوري لايكا M165 إف سي التريكايين (3-حمض أمينوبنزويك) سيجما ألدريتش أ -5040