$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. إزالة الخلايا
ملاحظة: تم تكييف هذا الإجراء من الطرق المنشورة سابقا والتي تركز على إزالة الخلايا الدهنية ، والتي تضمنت المنظف الأيوني deoxycholate الصوديوم بدلا من كبريتات دوديسيل الصوديوم لإزالة الحمض النووي بكفاءة.
- في اليوم 1 ، قم بإزالة ضمادات الدهون الثديية المجمدة أو الطابعات متعددة الوظائف من -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج في درجة حرارة الغرفة.
- بمجرد إذابتها ، جفف الطابعات متعددة الوظائف لفترة وجيزة على مسح مهمة دقيقة. قم بوزن الطابعات متعددة الوظائف باستخدام ميزان تحليلي.
- باستخدام زوج من الملقط مع مقص أو مشرط ، قسم الأنسجة إلى عينات 3 مم × 3 مم × 3 مم لدراسة ECM السليمة والأنسجة المتبقية لإنتاج الهيدروجي><ل.
ملاحظه: يعتمد عدد العينات على عدد طرق الاختبار ، على سبيل المثال يتم وصف جمع عينتين أدناه: واحدة لتضمين البارافين (الخطوة 1.5) والأخرى للتجميد في وسط تضمين الناجمة عن البرد ، إذا رغبت في ذلك (انظر جدول المواد والخطوة 1.6).
- وزن الأنسجة. في حالة التضمين في البارافين للتقسيم ، فتابع الخطوة 1.5. في حالة التجميد في وسط تضمين ناظم التبريد للتقسيم ، فاستمر في الخطوة 1.6.
- في غطاء كيميائي ، اغمر الأنسجة في الفورمالين المحايد المخزن بنسبة 10٪ (NBF) (انظر جدول المواد) لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. اغسل 3 مرات في PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما. اغمر الأنسجة في 30٪ سكروز لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- قم بوزن الأنسجة الآن بعد إزالة هذه القطعة. تابع إلى الخطوة 1.6.
- في غطاء كيميائي ، ضع قطع MFP في كاسيت مكتوب عليه محضر بوسيط تضمين ناظم البرد. أضف المزيد من وسط تضمين cryostat لتغطية الأنسجة.
- ضع الكاسيت في دورق من 2-ميثيل بوتان (انظر جدول المواد) يتم تبريده مسبقا بالنيتروجين السائل. يجب أن يحتوي الدورق على ما يكفي من 2-ميثيل بوتان لتغطية الجزء السفلي ولكن ليس بما يكفي لغمر الكاسيت لأن وسط تضمين التبريد يجب ألا يلمس 2-ميثيل بوتان. دع الكاسيت يجلس في 2-ميثيل بوتان حتى يتجمد وسط تضمين ناظم التبريد ويصبح معتما.
- لف الكاسيت (الكاسيت) بورق الألمنيوم ، والملصق ، واتركه عند -80 درجة مئوية حتى يستخدم للتقسيم.
ملاحظه: تم تقسيم الأنسجة الموضوعة على الفور في وسط تضمين ناظم التبريد عند 5 ميكرومتر بينما تم تقسيم الأنسجة المحتضنة في السكروز عند 30 ميكرومتر للاحتفاظ بمورفولوجيا الخلايا الشحمية.
- استخدم الملقط لتدليك الأنسجة المتبقية يدويا.
ملاحظه: يمكن أيضا وضع قطع المناديل في 10٪ NBF لمدة 24-48 ساعة ، وشطفها في PBS ، وتركها في 70٪ من الإيثانول حتى يتم تضمينها في البارافين. بعد التضمين ، يمكن استخدام أقسام 5 ميكرومتر لتلوين الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) (انظر القسم 2 أدناه).
- ضع الطابعات متعددة الوظائف في أطباق 6 سم مع محلول 5 مل 0.02٪ تريبسين / 0.05٪ EDTA. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. رش الأطباق وامسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول قبل وضعها في الحاضنة.
- استخدم مصافي 0.7 مم لغسل الطابعات متعددة الوظائف بالماء منزوع الأيونات (DI) عن طريق سكب الماء على الأنسجة ثلاث مرات. استخدم الملقط لتدليك المناديل يدويا بين الغسل.
- جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة حساسة ، وامسحها ووزنها. ضع المناديل في دورق معقم مسبقا يحتوي على شريط تقليب بحجم مناسب. قم بتغطية الأنسجة ب 60 مل من 3٪ t-octylphenoxypolyethoxyethanol (انظر جدول المواد) لكل 1 غرام من الأنسجة وحركها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. استخدم 20 مل على الأقل.
- قم بتفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة. اشطف الدورق بماء DI واسكبه على المناديل. كرر مرتين أخريين. استخدم الملقط لتدليك الأنسجة يدويا بين عمليات الشطف.
- جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة حساسة ، وامسحها ووزنها. ضع المناديل وقضبان التقليب مرة أخرى في نفس الأكواب ، وقم بتغطيتها ب 60 مل من 4٪ حمض الديوكسيكوليك لكل 1 غرام من الأنسجة. يقلب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. استخدم 20 مل على الأقل.
- قم بتفريغ المناديل والمحتويات في مصفاة شبكية. اشطف الدورق بماء DI واسكبه على المناديل. كرر مرتين أخريين. استخدم الملقط لتدليك الأنسجة يدويا بين عمليات الشطف.
- جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة حساسة ، وامسحها ووزنها.
- ضع المناديل في نفس الدورق بماء DI العذب المكمل بنسبة 1٪ بنسلين ستربتومايسين. غطيها بإحكام بغشاء البارافين. اتركيه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- اغسل المصافي والأكواب لاستخدامها في اليوم التالي.
- في اليوم 2 ، صفي محتويات الدورق في مصفاة. جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة حساسة ، وامسحها ووزنها.
- ضع الطابعات متعددة الوظائف في نفس الدورق باستخدام شريط تحريك بحجم مناسب. غطيها ب 60 مل 4٪ إيثانول / 0.1٪ محلول حمض البيراسيتيك لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدم 20 مل على الأقل. يقلب لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- قم بتفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 مم. استخدم الملقط لتدليك الأنسجة يدويا. ضع المحتويات مرة أخرى في الدورق اغسل المناديل عن طريق تغطيتها ب 60 مل من 1x PBS لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدم 20 مل على الأقل. يقلب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر مرة واحدة.
- قم بتفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 مم. استخدم الملقط لتدليك الأنسجة يدويا. ضع المحتويات مرة أخرى في الدورق اغسل المناديل عن طريق تغطيتها ب 60 مل من ماء DI لكل 1 غرام من المناديل. استخدم 20 مل على الأقل. يقلب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر مرة واحدة.
- جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة حساسة ، وامسحها ووزنها. قم بتفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة. استخدم الملقط لتدليك الأنسجة يدويا.
- ضع المحتويات مرة أخرى في الدورق قم بتغطية المناديل ب 60 مل من 100٪ n-propanol لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدم 20 مل على الأقل. يقلب لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة حساسة ، وامسحها ووزنها. قم بتفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة 0.7 مم. استخدم الملقط لتدليك الأنسجة يدويا.
- ضع المحتويات مرة أخرى في الدورق اغسل المناديل عن طريق تغطيتها ب 60 مل من ماء DI لكل 1 غرام من الأنسجة. استخدم 20 مل على الأقل. يقلب لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر ثلاث مرات.
- قم بتفريغ الأنسجة والمحتويات في مصفاة. كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.6 لجمع قطع من الأنسجة لحضانة السكروز والتجميد في وسط تضمين ناظم البرد.
- جفف الأنسجة لفترة وجيزة على مهمة حساسة ، وامسحها ووزنها. ضعها في أنبوب 15 مل مسمى عليه. جمد عند -80 درجة مئوية طوال الليل.