نقش السرطان الغدي: طريقة لزرع الخلايا السرطانية في رئتي الفئران

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Stevens، L.E. et al، التكييف المسبق للممرات الهوائية للفئران مع البيوميسين يزيد من كفاءة نقش خلايا سرطان الرئة التقويمي. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو طريقة لتطعيم خلايا سرطان الرئة الغدي في رئتي الفئران عن طريق تكييف الشعب الهوائية مسبقا بعامل تحفيز التليف - البيوميسين. تعزز هذه الطريقة بشكل كبير نقش تقويم العظام لخلايا سرطان الرئة في رئتي الفئران

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. علاج البيوميسين

1. خطط لحقن الفئران عن طريق القصبة الهوائية بالبليومايسين قبل 14 يوما من نقش الخلايا السرطانية.
2. قم بإذابة مخزون البلومايسين على الثلج قبل 2 ساعة من الحقن.
3. بمجرد إذابته ، قم بتخفيف البلومايسين إلى تركيز العمل المطلوب (0.02 U / 50 ميكرولتر أو 0.005 U / 50 ميكرولتر) ، واحتفظ به على الجليد.
   ملاحظه: يعتمد تركيز البليومايسين على سلالة الفئران المستخدمة في التجارب (الجدول 1). يجب إجراء معايرة البليومايسين في الفئران لتحديد الجرعة المثلى.
4. تحضير التخدير عن طريق تخفيف الكيتامين والزيلازين إلى تركيز نهائي 10 ملغم/مل و1 ملغم/مل على التوالي، باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 27 جم، تخدير كل فأر عن طريق حقن محلول الكيتامين / الزيلازين داخل الصفاق بمعدل 100/10 ملغم/كغ على التوالي.
5. راقب تنفس الفئران واستخدم قرصة إصبع القدم. تأكد من التخدير المناسب عندما لا يستجيب الماوس لقرص إصبع القدم. ضع مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
6. ضع فأرة واحدة في كل مرة على منصة التنبيب عن طريق تعليق أسنانه الأمامية مع ظهره على المنصة.
7. قم بإضاءة الجزء العلوي من الصدر باستخدام مصباح إضاءة من الألياف الضوئية للمساعدة في تصور القصبة الهوائية. افتح فم الفأر واسحب اللسان برفق باستخدام ملقط مسطح معقم.
8. استخدم قسطرة وريدية بدون إبرة لتجنب انسداد التنفس. ضع القسطرة فوق الضوء الأبيض المنبعث من فتحة القصبة الهوائية.
9. أدخل القسطرة في القصبة الهوائية حتى يصل الجزء العلوي من القسطرة إلى الأسنان الأمامية. تأكد من وضع القسطرة بشكل صحيح في القصبة الهوائية من خلال تصور الضوء الأبيض الساطع من خلال فتحة القسطرة في الفم.
10. باستخدام ماصة ، قم بتوزيع 50 ميكرولتر من البليومايسين أو السيارة (PBS) مباشرة في القسطرة لضمان استنشاق الحجم بالكامل. قم بتنفيذ هذه الخطوة في ظل ظروف معقمة.
11. إذا تم إدخال القسطرة بشكل صحيح ، فسوف يستنشق الماوس محتويات القسطرة على الفور. انتظر بضع ثوان حتى ينتقل مستوى الصوت بالكامل إلى أسفل القسطرة. ثم قم بإزالة القسطرة من القصبة الهوائية وتخلص منها في محلول مبيض بنسبة 10٪.
    ملاحظه: يبلغ متوسط الوقت لكل ماوس من الخطوات 1.7-1.11 حوالي 5 دقائق.
12. إذا كان الماوس لا يستنشق السائل ، فاراقب التنفس بعناية واضبط موضع القسطرة. إذا توقف الفأر عن التنفس، فقم بإزالة القسطرة على الفور واسمح للفأر باستئناف التنفس بشكل طبيعي قبل إعادة إدخال القسطرة.
13. ضع الماوس المحقون على وسادة تسخين معتمدة من IACUC على ظهره على سطح مستو للتعافي. سيستغرق الإجراء بأكمله 10 دقائق لكل ماوس. لا تعيد الذي خضع للحقن إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما.
14. ضع بطاقة "مادة كيميائية خطرة قيد الاستخدام" على القفص لمدة 24 ساعة.

< p class = "jove_title" >2. نقش خطوط خلايا سرطان الرئة الغدي

< p class = "jove_content" >ملاحظة: قم بإجراء نقش الخلايا بعد 14 يوما من حقن البيوميسين (الخطوة 1.1)

1. اسمح للخلايا بالنمو في قوارير 75 سم² دون إزعاج لمدة 3 أيام قبل يوم الحقن باستخدام الوسائط المقابلة كما هو مذكور في الخطوة 1.3.
   ملاحظه: يجب أن تكون 80٪ ملتقية في يوم الحقن (وهو ما يتوافق مع 2-3 × 10⁶ في كل قارورة اعتمادا على خط الخلية).
2. اغسل الخلايا التي تنمو على قوارير 75 سم² مع 5 مل من PBS في درجة حرارة الغرفة.
3. قم بشفط PBS وأضف 1.5 مل من التربسين إلى الخلايا واحتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل الخلايا (عادة 2-5 دقائق).
   ملاحظه: نوصي بالتحقق كل دقيقتين بحثا عن انفصال الخلية عن البلاستيك عن طريق التصور البسيط لقاع القارورة أو تحت المجهر الضوئي. لا تتجاوز 5 دقائق من الحضانة مع التربسين.
4. قم بتحييد التربسين بإضافة 4 مل من الوسائط التي تحتوي على 10٪ FBS (نفس وسائط الخطوة 2.1). اجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل وقم بطردها بدرجة حرارة 200 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. استنشق الوسائط وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من PBS لغسل الخلايا. الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة لخلايا الحبيبات. كرر هذا 1 مرة.
6. استنشق PBS وأعد تعليق الحبيبات في 1.5 مل من PBS لكل قارورة.
7. امزج 50 ميكرولتر من خليط الخلايا مع 50 ميكرولتر من التريبان الأزرق وعد الخلايا باستخدام غرفة عداد الخلايا / مقياس الدم.
8. قم بإعداد تعليق الخلية عن طريق تخفيف الخلايا في PBS لحقن 1 × 10⁵ خلايا (أو كمية أخرى مشار إليها) في 50 ميكرولتر لكل فأر. احتفظ بالخلايا على الجليد قبل الحقن.
   ملاحظه: قم بإعداد مرتين على الأقل من الخلايا للحقن لتجنب نفاد معلق الخلية.
9. تحضير التخدير عن طريق تخفيف الكيتامين والزيلازين إلى تركيز نهائي 10 مجم / مل و 1 مجم / مل ، على التوالي ، باستخدام حقنة 1 مل وإبرة 27 جم ، تخدير كل فأر عن طريق حقن محلول الكيتامين / الزيلازين داخل الصفاق عند 100/10 مجم / كجم على التوالي.
10. راقب تنفس الفئران واستخدم قرصة إصبع القدم. تأكد من التخدير المناسب عندما لا يستجيب الماوس لقرص إصبع القدم. ضع مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
11. ضع فأرة واحدة في كل مرة على منصة التنبيب عن طريق تعليق أسنانه الأمامية مع ظهره على المنصة.
12. قم بإضاءة الجزء العلوي من الصدر باستخدام مصباح إضاءة من الألياف الضوئية للمساعدة في تصور القصبة الهوائية.
13. أعد تعليق الخلايا برفق باستخدام ماصة p200 للتأكد من أنها لا تتشكل كتل. افتح فم الفأر واسحب اللسان برفق باستخدام ملقط مسطح معقم.
14. استخدم قسطرة وريدية مع إزالة الإبرة لتجنب انسداد التنفس. ضع القسطرة فوق الضوء الأبيض المنبعث من فتحة القصبة الهوائية.
15. أدخل القسطرة في القصبة الهوائية حتى يصل الجزء العلوي من القسطرة إلى الأسنان الأمامية. تأكد من وضع القسطرة بشكل صحيح في القصبة الهوائية من خلال تصور الضوء الأبيض الساطع من خلال فتحة القسطرة في الفم.
16. باستخدام ماصة، قم بتوزيع 50 ميكرولتر من الخلايا مباشرة في القسطرة لضمان استنشاق الحجم بالكامل. قم بتنفيذ هذه الخطوة في ظل ظروف معقمة.
    ملاحظه: إذا تم إدخال القسطرة بشكل صحيح ، فسوف يستنشق الماوس محتويات القسطرة على الفور.
17. انتظر بضع ثوان حتى ينتقل الحجم بالكامل إلى أسفل القسطرة ، ثم قم بإزالة القسطرة من القصبة الهوائية وتخلص من محلول التبييض بنسبة 10٪.
18. إذا كان الفأر لا يستنشق السائل ، فاراقب التنفس بعناية واضبط موضع القسطرة. إذا توقف الفأر عن التنفس ، فقم بإزالة القسطرة على الفور واسمح للفأر باستئناف التنفس بشكل طبيعي قبل إعادة إدخال القسطرة.
    ملاحظه: يبلغ متوسط الوقت لكل ماوس من الخطوات 2.11-2.18 حوالي 5 دقائق.
19. ضع الماوس المحقون على وسادة تسخين معتمدة من IACUC على ظهره على سطح مستو للتعافي.
    ملاحظه: سيستغرق الإجراء بأكمله 10 دقائق لكل ماوس. لا تعيد الذي خضع للحقن إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما.
20. احلق منطقة الضلع بأكملها بطنيا وظهريا من B6129SF1 / J وسلالات الفئران الأخرى ذات الشعر الداكن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية قبل التصوير.
21. بعد 2-3 دقائق من حقن الخلية ، قم بحقن 100 ميكرولتر من اللوسيفيرين بشكل رجعي (15 مجم / مل) باستخدام إبرة الأنسولين. قم بتبديل العين المستخدمة للحقن في كل جلسة تصوير.
22. بعد دقيقتين على الأقل ، ضع ما يصل إلى 5 فئران في جهاز تصوير التلألؤ البيولوجي الحيواني في وضع الاستلقاء الظهري واحصل على صورة بطنية باستخدام إعدادات التلألؤ .
23. أسفل لوحة التحكم، اضبط إعدادات الدقة والحساسية لقياس تلألؤ خط خلية معين. بالنسبة لمعظم التطبيقات، ابدأ ب 3 دقائق (أو "تلقائي" إذا كان مشبعا)، binning=متوسط (4)، f/stop=1، مجال الرؤية=D، ارتفاع الموضوع=1.50.
    ملاحظه: إذا نجح الحقن ، يتم الكشف عن إشارة التلألؤ في منطقة الصدر العلوية أو في رئة واحدة أو كلتا الرئتين.
24. اقلب الفئران على وضع الاستلقاء القصي واحصل على صورة ظهرية على النحو الوارد أعلاه.
    ملاحظه: إذا لم يتم إجراء حقن الخلايا بشكل صحيح ، فقد تتجمع الخلايا عند مدخل القصبة الهوائية أو في الرقبة.
25. حقن كيتوبروفين 5 ملغم/كغ داخل الصفاق لتخفيف الألم.
26. انقل الفئران مرة أخرى إلى قفصها وضع بطاقة "BSL-2 Agent قيد الاستخدام" على القفص.
27. راقب الفئران بحثا عن ضيق التنفس مباشرة بعد التنبيب ، ثم كل 15 دقيقة حتى تستيقظ الفئران من التخدير. لا تترك الفئران دون رقابة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
28. افحص الفئران بعد 24 ساعة من التنبيب وثلاث مرات في الأسبوع بحثا عن أي علامات على المرض.
29. احتفظ بسجل في سجل تاريخ الإجراء وتحديد هوية ونوع الإجراء ونوع ملاحظات التخدير والمراقبة بعد الجراحة والأوقات.
30. راقب الفئران بحثا عن فقدان الوزن ، وضيق التنفس ، والتشوهات السلوكية ، ودرجة حالة الجسم <2 (تجزئة العمود الفقري الواضح / عظام الحوض الظهرية واضحة) كل أسبوعين بعد تلقيح البليومايسين.
    ملاحظه: قد تظهر الفئران المصابة بأورام الرئة تهيجا في الجهاز التنفسي وفقدان الوزن والدنف و / أو الموت.
31. القتل الرحيم للفئران التي تعاني من ضائقة تنفسية أو الفئران التي عانت من فقدان كتلة الجسم بنسبة 15٪ عن طريق ثاني أكسيد الكربون أو الكيتامين / الزيلازين متبوعا بخلع عنق الرحم في حالة جمع الأنسجة. تأكد من القتل الرحيم عن طريق إجراء الجس لنشاط الجهاز التنفسي.

فئة

3. مراقبة نمو الورم عن طريق التصوير الحيوي

1. كرر تصوير الفئران في اليوم 3 بعد النقش وأسبوعيا بعد ذلك.
2. تخدير الفئران عن طريق حقن الكيتامين / الزيلازين (كما هو موضح في الخطوات 2.4-2.5) أو عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (2٪). راقب تنفس الفئران واستخدم قرصة إصبع القدم لتأكيد التخدير المناسب. ضع مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
3. حلق منطقة الضلع بأكملها من الناحية البطنية والظهرية من B6129SF1 / J وسلالات الفئران الأخرى ذات الشعر الداكن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية قبل التصوير.
4. بمجرد أن تخضع الفئران للتخدير ، قم بحقن 100 ميكرولتر من اللوسيفيرين بشكل رجعي (15 مجم / مل) باستخدام إبرة الأنسولين. انتظر 2 دقيقة. قم بتبديل العين المستخدمة للحقن في كل جلسة تصوير.
5. ضع الفئران في جهاز التصوير واحصل على صور ظهرية وبطنية كما هو موضح في الخطوات 2.22-2.24.
6. ضع الفئران مرة أخرى في القفص بعد التصوير ، على ظهورها على سطح مستو للتعافي.
   ملاحظه: سيستغرق الإجراء بأكمله 5 دقائق لكل مجموعة من 5 فئران. لا تترك الفئران دون رقابة حتى تستعيد وعيها الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي.
7. قم بتحليل الصور باستخدام برنامج تحليل التصوير / التلألؤ الحيوي.

النتائج

الجدول 1: قائمة الجرعات الموصى بها من البيوميسين لسلالات الفئران التي تم اختبارها.

إجهاد الماوس خط الخلية عدد الخلايا التي تم حقنها >٪ نقش p قيمة ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حامل التنبيب القوارض برينتري العلمية ريس -100 الحامل الموصى به للحقن داخل القصبة الهوائية بليوميسين سيغما B5507-15UN تحذير المخاطر الصحية GHS08 قسطرة إكسل 24 جرام صياد 1484121 إزالة الإبرة. للحقن داخل القصبة الهوائية الكيتامين (كيتاسيت inl 100 مجم / مل C3N 10 مل) بتلر شاين 56344 لتخدير الفئران زيلازين بتلر شاين 33198 لتخدير الفئران حقنة 1 مل دينار بحريني / فيشر 14-823-434 للحقن داخل الصفاق مرهم العيون البيطري Puralube شركة بتلر لصحة ذ.م.م 8897 لمنع جفاف العين أثناء التخدير MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 دولان جينر للصناعات MI-150 / EEG2823M لإلقاء الضوء على القصبة الهوائية وتصورها ملقط Graefe ، 2.75 (7 سم) سيرات طويلة روبوز RS-5111 للحقن داخل القصبة الهوائية قارورة T / C رقبة مقاس 75 سم مربعة ، غطاء أزرق فيشر / كورنينج 353135 محلول ملحي مخزن بالفوسفات تقنيات الحياة 14190-144 0.25٪ تريبسين EDTA تقنيات الحياة هاتف: 25200-056 ماصة Pipet-Lite ، UNV. SL-200XLS+ مطار ميتلر توليدو الدولي 17014411 عداد الخلايا الآلي للكونتيسة تقنيات الحياة AMQAX1000 مسحوق د-لوسيفيرين شركة بيركين إلمر للعلوم الصحية 122799 للتصوير المضيء. أعد تكوين المسحوق مع PBS لتركيز عمل 15 مجم / مل. الحماية من الضوء IVIS الطيف Xenogen Bioluminiscence شركة بيركين إلمر للعلوم الصحية 124262 للتصوير التلألؤ البيولوجي في الجسم الحي B6129SF1 / J الفئران مختبرات جاكسون 101043 خلايا المعاهد الوطنية للصحة H2030 ATCC رقم التعريف الشخصي CRL-5914 خلايا PC9 Nguyen DX et al. Cell. 2009; 138: 51-62 برنامج الصور الحية شركة بيركين إلمر للعلوم الصحية 128113 لتحليل التلألؤ البيولوجي في الجسم الحي