تصاعد الجرعة: طريقة لتطوير مقاومة الأدوية في الخلايا السرطانية

الملخص

المصدر: Yamaoka T. et al. ، إنشاء وتوصيف ثلاثة خطوط خلايا لسرطان الرئة الغدي PC-9 المقاومة للأفاتينيب تم تطويرها بجرعات متزايدة من Afatinib. J. Vis. Exp. ، 2019

يصف الفيديو تطور مقاومة الأدوية في الخلايا السرطانية عن طريق تعريض الخلايا لجرعات متصاعدة من الدواء بعد حساب قيم IC₅₀ للدواء سابقا باستخدام اختبار MTT. يصف بروتوكول العينة العملية خطوة بخطوة لتطوير الخلايا المقاومة للأدوية.

البروتوكول

فئة

1. إنشاء ثلاثة خطوط خلايا PC-9 مستقلة مقاومة للأفاتينيب

1. تحديد تركيز التعرض الأولي للأفاتينيب لخلايا PC-9 باستخدام مقايسة 3- (4،5-dimethylthiazol-2-yl) -2،5- diphenyltetrazolium bromide (MTT).
   1. زراعة خلايا PC-9 في وسط النمو الذي يحتوي على مصل الأبقار الجنينية (10٪) والبنسلين (100 وحدة / مل) والستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) في صحن معالج بزراعة الخلايا بحجم 10 سم في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₅٪ عند 37 درجة مئوية.
   2. أعد تعليق خلايا PC-9 عند 4 × 10⁴ خلايا / مل في وسط النمو ثم البذور عند 50 ميكرولتر / بئر في صفيحة دقيقة 96 بئر. التركيز النهائي للخلايا هو 2.0 × 10³ خلايا / 50 ميكرولتر / بئر. احتضن طوال الليل في حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية.
   3. أضف 50 ميكرولتر من محلول الأفاتينيب بتركيزات مختلفة: 0 ، 0.002 ، 0.006 ، 0.02 ، 0.06 ، 0.2 ، 0.6 ، 2 ، 6 ، و 20 ميكرومتر إلى الآبار التي تحتوي على وسط النمو (50 ميكرولتر). الحجم النهائي وتركيزات الأفاتينيب هي 100 ميكرولتر و 0 ، 0.001 ، 0.003 ، 0.01 ، 0.03 ، 0.1 ، 0.3 ، 1 ، 3 ، و 10 ميكرومتر ، على التوالي.
   4. احتضان اللوحة المكونة من 96 بئرا لمدة 96 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5٪ عند} 37 درجة مئوية.
   5. أضف 15 ميكرولتر من محلول الصبغة (انظر جدول المواد) إلى كل بئر واحتضن لمدة 4 ساعات في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_بنسبة 5٪ عند 37 درجة مئوية ، ثم أضف 100 ميكرولتر من محلول الذوبان / التوقف (انظر جدول المواد) إلى كل بئر واحتضانه طوال الليل في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5}٪ عند 37 درجة مئوية.
   6. قم بقياس الكثافة الضوئية عند 570 نانومتر (OD₅₇₀) باستخدام قارئ الألواح الدقيقة (انظر جدول المواد). قم بإعداد 6-12 تكرارا وكرر التجارب ثلاث مرات على الأقل.
   7. استخدم البرامج الإحصائية (انظر جدول المواد) لرسم هذه البيانات بيانيا كرسم بياني لرسم بياني شبه لوغاريتمي وحساب قيمة IC₅₀ ، وهو تركيز الدواء الذي يقلل من الاستجابة إلى 50٪ من الحد الأقصى (انظر جدول المواد).
2. التعرض المستمر لخلايا PC-9 ل EGFR-TKI الذي لا رجعة فيه ، أفاتينيب ، عن طريق تصعيد الجرعة التدريجية في ثلاثة أطباق مستقلة مقاس 10 سم
   1. زراعة خلايا PC-9 في أطباق p100 تحتوي على 10 مل من وسط النمو. عندما تصل خلايا PC-9 إلى مرحلة التقاء فرعي ، انقل 1 مل من تعليق الخلية إلى ثلاثة أطباق p100 جديدة ، مع 9 مل من وسط النمو. تصبح خلايا PC-9 المخففة 1:10 شبه ملتقية في غضون 3-4 أيام ، بعدد خلية يبلغ حوالي 4-5 × 10⁵ خلايا / مل.
   2. في اليوم التالي ، أضف 1/10 من قيمة IC₅₀ من أفاتينيب إلى كل من أطباق p100 الثلاثة.
      ملاحظة: يعاد تكوين أفاتينيب في DMSO بتركيزات مخزون تبلغ 1 ميكرومتر و 10 ميكرومتر و 100 ميكرومتر و 1 ملي مولار و 5 مليمتر. يضاف 1 إلى 10 ميكرولتر من محلول الأفاتينيب إلى 10 مل من وسط النمو في المزرعة ، وفقا للتركيزات النهائية المطلوبة.
   3. عندما تصبح الخلايا الموجودة في أطباق p100 المحتوية على الأفاتينيب شبه متجانسة ، تخلط جيدا عن طريق الشفط باستخدام ماصة سعة 1 مل وأضف 1 مل من معلق الخلية إلى 9 مل من وسط النمو الطازج في طبق p100 جديد. بعد ذلك ، أضف تركيزات أعلى بنسبة 10-20٪ من الأفاتينيب إلى الثقافة الجديدة.
   4. زيادة تركيز الأفاتينيب من 0.1 نانومتر إلى 1 ميكرومتر في الوسط عن طريق تصعيد الجرعة التدريجية مع زيادة تركيز الأفاتينيب بنسبة 10-20٪ في كل خطوة خلال فترة 10-12 شهرا.
      ملاحظه: عندما يقترب تركيز الأفاتينيب من قيمة IC₅₀ ، يصبح نمو الخلية بطيئا جدا. إذا تم تقسيم الخلايا 1: 9 ، فقد لا تنمو ، حيث يتم قتل هذه الخلايا بتركيزات أعلى من الأفاتينيب. لذلك ، عند تركيزات الأفانيتيب الأعلى ، يمكن تقسيم الخلايا بنسبة 1: 2. نمت الخلايا الأكثر مقاومة في وسط يحتوي على الأفاتينيب لمدة 3-14 يوما ، ولم يتم تغيير الوسط حتى تحتاج الخلايا المقاومة إلى المرور.
   5. زراعة الخلايا المقاومة للأفاتينيب لمدة 2-3 أشهر في وسط نمو يحتوي على 1 ميكرومتر من الأفاتينيب. عند تركيز أفاتينيب يبلغ 1 ميكرومتر ، يلزم 10-12 شهرا لتطوير مقاومة الأفاتينيب في هذا النموذج. قم بإجراء اختبار MTT للتأكد من أن الخلايا مقاومة للأفاتينيب. تم تسمية خطوط خلايا مقاومة الأفاتينيب الثلاثة التي تم إنشاؤها بشكل مستقل باسم AFR1 و AFR2 و AFR3.

المواد