مقايسة تكوين المستعمرة: تقييم فعالية العوامل المضادة للسرطان على خلايا سرطان الرئة المكونة للمستعمرات

الملخص

المصدر: Lee ، J. Y.et al ، التقييم قبل السريري للنشاط الحيوي للكومارين المضاد للسرطان OT48 بواسطة الكرات الكروية ، ومقايسات تكوين المستعمرة ، وطعوم Xenofish الزردية.J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو مقايسة تكوين المستعمرة ، والتي تساعد في تحديد قدرة خلايا سرطان الرئة على التكاثر إلى أجل غير مسمى وتشكيل مستعمرات فردية. يمكننا تحليل تأثير عامل مضاد للسرطان على الخلايا المكونة للمستعمرة من خلال تحليل التغيرات في عدد و / أو حجم المستعمرات الناتجة.

البروتوكول

1. فحوصات تشكيل المستعمرة

1. زراعة الخلايا A549 بتركيز 20,000 خلية/سم² في 15 مل من وسط زراعة الخلايا RPMI1640 المكمل ب 10٪ FBS (مصل الأبقار الجنينية) و1٪ مضادات حيوية في قارورة 75 سم² في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
2. في يوم التجربة ، حدد تركيز الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم. اجمع 50,000 خلية عن طريق الطرد المركزي عند 400 × جم لمدة 7 دقائق في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وأعد تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر من 1x PBS المعقم (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) في أنابيب 1.5 مل.
3. قم بتوزيع 1.1 مل من الوسط شبه الصلب القائم على ميثيل السليلوز (MCBM) في أنابيب سعة 15 مل باستخدام ماصة متعددة. قم بإعداد أنبوب واحد لكل حالة.
4. أضف 110 ميكرولتر من FBS إلى 1.1 مل من MCBM باستخدام ماصة دقيقة P200.
5. خلايا البذور عند 1,000 خلية / مل. اجمع 2.4 ميكرولتر من معلق الخلية من محلول المخزون (50,000 خلية في 100 ميكرولتر من 1x PBS) باستخدام ماصة دقيقة P2 وأضفها إلى 1.1 مل من MCBM مكملة بنسبة 10٪ FBS.
6. بعد إضافة الخلايا ، قم بدوامة الأنابيب لمدة 1 دقيقة ، مع الاحتفاظ بها عموديا بأعلى سرعة لخلط MCBM والخلايا جيدا.
7. أضف مركبات الاختبار (OT48 وحدها أو بالاشتراك مع A1210477). قم بإعداد أنبوب منفصل كعنصر تحكم للمذيب المستخدم (هنا ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)). اعتمادا على تركيز المركبات والحجم المضاف لكل حالة ، سيشمل التحكم في المذيبات أعلى تركيز من المذيب المستخدم في تخفيفات مركب الاختبار ، لتقييم الآثار الضارة التي يسببها المذيب.
8. أنابيب دوامة لمدة 1 دقيقة.
9. لكل فحصة، أضف 1 مل من الخليط مع ماصة دقيقة P1000 إلى البئر المركزي للوحة زراعة الخلايا المكونة من 12 بئرا.
10. املأ الآبار الفارغة ب 1 مل من الماء المعقم أو 1x PBS لتحقيق الاستقرار في الرطوبة.
11. احتضان ألواح الاستزراع لمدة 10 أيام في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂
12. بعد 10 أيام من الحضانة ، أضف 200 ميكرولتر من محلول مخزون MTT (ميثيل ثيازوليلديفينيل-تيترازوليوم بروميد) (5 مجم / مل) إلى كل بئر للوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 مجم / مل.
13. احتضان لمدة 10 دقائق في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. سوف تتحول المستعمرات القابلة للحياة إلى اللون البنفسجي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أ 549 ATCC CCL-185 37 درجة مئوية RPMI 1640 لونزا 30096 4 درجة مئوية FBS الغرب الحيوي S1520-500 -20 درجة مئوية البنسلين - ستربتومايسين لونزا 17-602 [إ] -20 درجة مئوية قارورة زراعة الخلية T75 الاسكتلندي 70075 RT حل PBS هيكلون SH30256.02 RT أنبوب 1.5 مل خارج الجين أنبوب 170-ج RT أنبوب 15 مل هيونداي مايكرو H20015 RT 12 طبق بئر الاسكتلندي 30012 RT ميثيكولت تقنيات الخلايا الجذعية 4230 دولار -20 درجة مئوية ثيازوليل بلو تيترازوليوم برومايد (مسحوق MTT) سيغما م 5622 4 درجة مئوية LAS4000 جنرال إلكتريك لتقنيات الرعاية الصحية RT