فحص الطعم الزينوغرافي لسمك الزرد: طريقة لتقييم فعالية العلاجات المضادة للسرطان على الأورام في أسماك الزرد في الجسم الحي

الملخص

المصدر: Lee ، J. Y et al. ، التقييم قبل السريري للنشاط الحيوي للكومارين المضاد للسرطان OT48 بواسطة الكرات الكروية ، وفحوصات تكوين المستعمرة ، وطعوم الزرد الزينوية.J. Vis. Exp. (2018)

يصف هذا الفيديو مقايسة xenograft لسمك الزرد لتقييم تكوين الورم في الجسم الحي ودراسة تأثير العوامل العلاجية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. فحص Xenograft لأسماك الزرد

ملاحظة: يتم تصور هذا النهج الفني على أنه تخطيطي (الشكل 1).

1. تحضير كواشف المخزون
   1. قم بإعداد 1 لتر من محلول 30x Danieau: 1740 ملي كلوريد الصوديوم ، 21 ملي كلوريد كلوريد ، 12 ملي مللي ملغم 4 • 7 ساعة 2 ، 18 ملي كالسيوم (NO₃) ₂ ، و 150 ملي هيبس. اضبط على درجة الحموضة في المخزن المؤقت إلى 7.6 باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني.
   2. تحضير محلول ثلاثي الأبعاد 1٪ (50x): قم بإذابة 20 مجم من إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سلفونات (tricaine) في 2 مل من الماء المقطر.
   3. تحضير محلول 1٪ فينول Red-PBS: أضف 2 ميكرولتر من محلول ملح الصوديوم الأحمر الفينول إلى 198 ميكرولتر من محلول PBS المعقم في أنبوب 1.5 ميكرولتر.
   4. تحضير 3٪ ميثيل السليلوز: أضف 3 جم من ميثيل السليلوز إلى 100 مل من محلول 1x Danieau.
2. إنتاج وحضانة بيض الزرد
   1. افصل أنثى وذكر من سمك الزرد في خزان فاصل مملوء بماء الصنبور المعقم بالأشعة فوق البنفسجية والمفلترة عند 28.5 درجة مئوية في الظلام. بعد 24 ساعة من الانفصال ، اخلطي الأسماك من كلا الجنسين لبدء التزاوج. انقل البيض المخصب من خزان التزاوج إلى طبق بتري يحتوي على 5 مل من محلول دانيو الطازج.
   2. اغسل البيض ثلاث مرات ب 5 مل من محلول دانيو. للغسيل ، قم بشفط البيض بعناية باستخدام ماصة ونقله إلى 5 مل من المحلول الطازج. احتضان لمدة 8 ساعات عند 28.5 درجة مئوية.
      1. بعد 8 ساعات من الحضانة في محلول دانيو ، قم بالتغيير إلى محلول دانيو الذي يحتوي على 0.03٪ 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU) لتثبيط التصبغ. فرز البويضات غير الشفافة (غير المخصبة أو التي تحتوي على أجنة غير مكتمنة) لمنع التلوث.
3. تمزق الأجنة
   بعد
   1. 24 ساعة من الإخصاب (HPF) ، أجنة أسماك الزرد dechorionate باستخدام ملقط حاد. احتضان أجنة الفقس في محلول دانيو بنسبة 0.03٪ PTU عند 28.5 درجة مئوية حتى 48 حصان.
4. تحضير الخلايا المعالجة بالمركبات
   1. خلايا البذور A549 عند 20,000 خلية / سم² في قوارير 25 سم². بعد 24 ساعة من البذر ، أضف مركبات (هنا OT48 عند 50 ميكرومتر و / أو A1210477 عند 20 ميكرومتر) لمدة 24 ساعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   2. قم بإعداد وقت العلاج لكل مركب للحفاظ على صلاحية الخلايا ولكن لإلزامها بموت الخلايا. يجب إعداد هذه النقطة الزمنية بشكل فردي بناء على قابلية الخلية للحياة والتشكل والعلامات الجزيئية.
   3. قبل ساعتين من نهاية العلاج ، تلطخ الخلايا مع 4 ميكرومتر من صبغة تعقب الخلايا الفلورية CM-Dil عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. بعد ساعتين من الحضانة ، قم بتربسين الخلايا بنسبة 0.05٪ تربسين EDTA ، وقم بتخفيف 106 خلايا في 50 ميكرولتر من محلول الفينول Red-PBS قبل الحقن.
5. الحقن المجهري للخلايا السرطانية لتكوين الطعم الغريب
   1. قم بتخدير سمك الزرد في محلول ثلاثي الكنائين بنسبة 0.02٪ لمدة 5 دقائق حتى يستقر على طبق أجار.
   2. اسحب شعيرات دموية زجاجية مقاس 1.0 مم (القطر الخارجي (OD) بواسطة مجتذب ماصة دقيقة (إعدادات البرنامج: P: 300، الحرارة: 260، السحب: 60، VEL: 50، والوقت: 200). قطع الشعيرات الدموية الدقيقة مع حقنة لإنتاج حافة حادة. قم بتحميل الشعيرات الدموية الدقيقة ب 20 ميكرولتر من محلول الخلية / الفينول Red-PBS. اضبط ضغط الحقن والوقت لتوزيع 2 نانولتر لكل حقنة.
   3. حقن 100-200 خلية في كيس صفار البيض عن طريق حقن 6 إلى 10 نانولتر عن طريق 3 إلى 5 حقن. بعد الحقن ، اترك الأسماك تتعافى لمدة 10 إلى 30 دقيقة في 5 مل من محلول دانيو الطازج الذي يحتوي على محلول PTU. يتم إرسال الأسماك في أطباق 24 بئرا مع 1 مل من محلول دانيو الذي يحتوي على محلول PTU واحتضانها لمدة 72 ساعة عند 28.5 درجة مئوية.
   4. بعد 72 ساعة من الحضانة ، قم بتخدير الأسماك في محلول ثلاثي الكنائين بنسبة 0.02٪ وشل حركتها على شريحة زجاجية بانخفاض 3٪ ميثيل سليلوز. التقط 5x صورا عن طريق المجهر الفلوري بطول موجي من 620 إلى 750 نانومتر.
   5. تحديد حجم أورام الفلورسنت بواسطة برنامج ImageJ. حدد القائمة "تحليل | قياس". احفظ القيم المقابلة لإشارة الفلورسنت وقم بتحليلها باستخدام برنامج إحصائي للتمثيل الرسومي.

النتائج

الشكل 1: رسم تخطيطي للعملية الشاملة لمقايسة الطعم الغريب لسمك الزرد.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أ 549 ATCC CCL-185 37 درجة مئوية RPMI 1640 لونزا 30096 4 درجة مئوية FBS الغرب الحيوي S1520-500 -20 درجة مئوية البنسلين - ستربتومايسين لونزا 17-602 [إ] -20 درجة مئوية قارورة زراعة الخلية T25 الاسكتلندي 70025 RT قارورة زراعة الخلية T75 الاسكتلندي 70075 RT قارورة زراعة الخلية T175 الاسكتلندي 71175 RT أنبوب 1.5 مل خارج الجين أنبوب 170-ج RT 24 طبق بئر الاسكتلندي 30024 RT بتريديش الاسكتلندي 10100 RT حل PBS هيكلون SH30256.02 RT التربسين EDTA جيبكو 25-300-054 4 درجة مئوية كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش 71382 RT كلوريد البوتاسيوم (KCL) سيجما ألدريتش ص 9541 RT كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات (MgSO4.7H2O) سيجما ألدريتش M2773 RT نترات الكالسيوم رباعي هيدرات (Ca (NO3)2) سيجما ألدريتش [ك1396] RT محلول HEPES سيجما ألدريتش H0887 RT إيثيل 3-أمينوبنزوات ميثان سولفونات (تريكايين) سيجما ألدريتش [إ10521] RT محلول الفينول الأحمر سيجما ألدريتش P0290 RT ميثيل السليلوز سيجما ألدريتش م 0512 RT 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU) سيجما ألدريتش ص 7629 RT صبغة CM-Dil إنفيتروجين سي 7001 -20 درجة مئوية الشعيرات الدموية الزجاجية أدوات الدقة العالمية تي دبليو 100 إف -4 RT مجتذب الماصات الدقيقة أداة الغالق ، الولايات المتحدة الأمريكية ف-97 RT حاقن صغير أدوات الدقة العالمية PV820 RT حقنة كوفاكس 1 مل RT محمل صغير إيبندورف 5242956003 RT شريحة زجاجية مارينفيلد هس يو-1000612 RT الفحص المجهري الفلوري لايكا DE / DM 5000B RT