فحص السمية الضوئية في المختبر: طريقة قائمة على PDT لتقييم الإمكانات السمية الضوئية لمحسس الضوء في خلايا سرطان الرئة

الملخص

المصدر: Chang, J. E., et al. الفعالية المضادة للسرطان للعلاج الضوئي الديناميكي مع الجسيمات النانوية التي تستهدف سرطان الرئة.J. Vis. Exp.(2016).

العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) هو طريقة غير جراحية وغير جراحية لعلاج سرطان الرئة. تتراكم المحسسات الضوئية بشكل انتقائي في أنسجة الورم وتؤدي إلى موت الخلايا السرطانية في وجود الأكسجين والطول الموجي المناسب للضوء. في فيديو البروتوكول هذا ، يتم استخدام الطريقة المستندة إلى PDT لتقييم الإمكانات السامة للضوء لمحسس ضوئي محتمل في خلايا سرطان الرئة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تخليق حمض الهيالورونيك - سيراميد (HACE)

1. قم بإذابة 12.21 مليمول من أوليغومر حمض الهيالورونيك (HA) و 9.77 مليمول من هيدروكسيد tetra-n-butylammonium (TBA) في 60 مل من الماء المقطر المزدوج (DDW). يقلب لمدة 30 دقيقة.
2. لتصنيع رابط DS-Y30 ، قم بإذابة 8.59 مليمول من سيراميد DS-Y30 و 9.45 مليمول من ثلاثي إيثيل أمين في 25 مل من رباعي هيدروفوران (THF). تخلط مع 8.59 مليمول من 4-كلورو ميثيل بنزويل كلوريد في THF. يقلب لمدة 6 ساعات عند 60 درجة مئوية.
3. قم بإذابة 8.10 مليمول من HA-TBA و 0.41 مليمول من رابط DS-Y30 في خليط من THF والأسيتونيتريل (4: 1 ، حجم / حجم). يقلب لمدة 5 ساعات عند 40 درجة مئوية.
4. قم بإزالة الشوائب عن طريق الترشيح باستخدام عامل الترشيح ، وتخلص من المذيب العضوي عن طريق التبخر الفراغي. قم بتنقية المنتج باستخدام غشاء غسيل الكلى (قطع الوزن الجزيئي: 3.5 كيلو دالتون) وتجميده.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الجسيمات النانوية

1. قم بإذابة 1 مجم من HB و 1 مجم من باكليتاكسيل في 0.5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وامزجه مع 0.5 مل من DDW عن طريق الخلط الدوامي لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بإذابة HACE في هذا الخليط عن طريق الخلط الدوامي لمدة 5 دقائق أخرى.
2. للتخلص من المذيب ، قم بالتسخين عند 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعات تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين.
3. أعد تعليق الفيلم المكون من HACE و HB و paclitaxel مع 1 مل من DDW. قم بالفلتر باستخدام مرشح حقنة (حجم المسام 0.45 ميكرومتر) لإزالة الأدوية غير المغلفة.

< ص الفئة = "jove_title" >3. في المختبر السمية الضوئية

1. امتصاص الجسيمات النانوية في خطوط خلايا سرطان الرئة
   1. تحضير مصل بقري الجنين RPMI-1640 يحتوي على 10٪ (حجم / حجم) متوسط يحتوي على 10٪ (حجم / حجم) بنسلين ستربتومايسين.
   2. خلايا البذور A549 في صفائح زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا بكثافة 1 × 10⁵ خلايا / بئر (ثلاث نسخ لكل مجموعة). احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في جو هوائي مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون_و 95٪.
   3. بعد ربط الخلية ، قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا بإضافة 1 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS).
   4. قم بإذابة الجسيمات النانوية في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 2 ميكرومتر / مل HB. بعد ذلك ، احتضن الخلايا ب 1 مل من PBS أو NPs الفارغة أو HB-NPs أو HB-P-NPs في كل بئر لمدة 4 ساعات في الظلام.
   5. قم بإزالة كل المحلول واغسل الخلايا بإضافة 1 مل من PBS البارد. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى. أضف وسط ثقافة جديدة.
2. مقايسة بقاء الخلية
   1. ضع لوحة زراعة الخلية تحت ألياف PDT (بمسافة 1 سم من ألياف PDT إلى البئر). ارتد نظارات أمان بالليزر وقم بإضاءة الخلايا بليزر PDT (630 نانومتر ، 400 ميجاوات / سم²) في الظلام لفترات زمنية مختلفة: 0 و 5 و 10 و 20 و 30 و 40 ثانية (0 و 2 و 4 و 8 و 12 و 16 J / cm²). ثم احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في الظلام.
   2. استنشق الوسط واغسل الخلايا بإضافة 1 مل من PBS البارد. كرر خطوة الغسيل مرة أخرى.
   3. أضف 10 ميكرولتر من محلول قياس السمية الخلوية لكل بئر. احتضن في الظلام لمدة 2 ساعة.
   4. قم بقياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ صفيحة دقيقة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حمض أوليغو الهيالورونيك شركة Bioland المحدودة DS-Y30 (سيراميد 3B ؛ بشكل رئيسي نوليويل-فيتوسفينجوسين) Doosan Biotech Co.، Ltd. حمض أديبيك ثنائي هيدرازيد سيجما ألدريتش أ 0638 N- (3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) -N ′- إيثيل كاربوديميد سيجما ألدريتش 39391 4- (كلورو ميثيل) بنزويل كلوريد سيجما ألدريتش 270784 باكليتاكسيل شركات تايهوا مرشح المحقنة Sartorius Stedim Biotech GmbH 17762 15 مم ، RC ، PP ، 0.45 ميكرومتر RPMI-1640 شركة Gibco Life Technologies، Inc. 11875 البنسلين - الستربتومايسين شركة Gibco Life Technologies، Inc. 15070 مصل الأبقار الجنينية شركة Gibco Life Technologies، Inc. 16140071 Celite (عامل تصفية) سيجما ألدريتش 6858 انظر الخطوة 1.4