تحليل الفعالية المضادة للأورام في الجسم الحي ل PDT: تقنية لتحديد الإمكانات السامة للضوء لمستشعر بالضوء في الفئران الحاملة للورم

الملخص

المصدر: Chang، J. E.، et al. الفعالية المضادة للسرطان للعلاج الضوئي الديناميكي مع الجسيمات النانوية المستهدفة بسرطان الرئة. J. Vis. Exp. (2016).

العلاج الضوئي الديناميكي (PDT) هو طريقة غير جراحية وغير جراحية لعلاج سرطان الرئة. تتراكم المحسسات الضوئية بشكل انتقائي في أنسجة الورم وتؤدي إلى موت الخلايا السرطانية في وجود الأكسجين والطول الموجي المناسب للضوء. يصف هذا الفيديو تحليل الفعالية المضادة للورم في الجسم الحي باستخدام المحسس الضوئي الذي يحتوي على جزيئات نانوية في فأر حامل للورم ، لتحديد الإمكانات السامة للضوء للحساسات الضوئية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تخليق حمض الهيالورونيك - سيراميد (HACE)

1. قم بإذابة 12.21 مليمول من أوليغومر حمض الهيالورونيك (HA) و 9.77 مليمول من هيدروكسيد tetra-n-butylammonium (TBA) في 60 مل من الماء المقطر المزدوج (DDW). يقلب لمدة 30 دقيقة.
2. لتصنيع رابط DS-Y30 ، قم بإذابة 8.59 مليمول من سيراميد DS-Y30 و 9.45 مليمول من ثلاثي إيثيل أمين في 25 مل من رباعي هيدروفوران (THF). تخلط مع 8.59 مليمول من 4-كلورو ميثيل بنزويل كلوريد في THF. يقلب لمدة 6 ساعات عند 60 درجة مئوية.
3. قم بإذابة 8.10 مليمول من HA-TBA و 0.41 مليمول من رابط DS-Y30 في خليط من THF والأسيتونيتريل (4: 1 ، حجم / حجم). يقلب لمدة 5 ساعات عند 40 درجة مئوية.
4. قم بإزالة الشوائب عن طريق الترشيح باستخدام عامل الترشيح ، وتخلص من المذيب العضوي عن طريق التبخر الفراغي. قم بتنقية المنتج باستخدام غشاء غسيل الكلى (قطع الوزن الجزيئي: 3.5 كيلو دالتون) وتجميده.

< p class = "jove_title" >2. تحضير الجسيمات النانوية

1. قم بإذابة 1 مجم من HB و 1 مجم من باكليتاكسيل في 0.5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) وامزجه مع 0.5 مل من DDW عن طريق الخلط الدوامي لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بإذابة HACE في هذا الخليط عن طريق الخلط الدوامي لمدة 5 دقائق أخرى.
2. للتخلص من المذيب ، قم بالتسخين عند 70 درجة مئوية لمدة 4 ساعات تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين.
3. أعد تعليق الفيلم المكون من HACE و HB و paclitaxel مع 1 مل من DDW. قم بالفلتر باستخدام مرشح حقنة (حجم المسام 0.45 ميكرومتر) لإزالة الأدوية غير المغلفة.

فئة

3. في الجسم الحي فعالية مضادة للسرطان في الفئران الحاملة للورم

1. نموذج الفأر الناجم عن سرطان الرئة
   1. قم بإعداد 1 × 10⁶ خلايا A549 في وسط 0.1 مل RPMI-1640 ؛ احتفظ بها في الثلج.
   2. تخدير الفئران بحقن الزيلازين ومزيج من التيلتامين والزولازيبام (1: 2 ، 1 مل / كغم). تأكد من التخدير المناسب عن طريق الضغط برفق على طية صغيرة من جلد الفأر. استخدم مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
      ملاحظه: إذا لم يتم ملاحظة أي حركة ، يتم تخدير بدرجة كافية لبدء التجارب.
   3. حقن الخلايا تحت الجلد في الأجنحة اليسرى للفئران العارية الذكور BALB / C (6-7 أسابيع ، 20-22 جم).
   4. استمر في مراقبة الفئران حتى تبدأ في التحرك حول القفص.
      ملاحظه: لا تترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. لا تعيد الذي خضع لعملية جراحية إلى صحبة أخرى حتى يتعافى تماما. احتفظ بالفئران في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF).
   5. قم بقياس حجم الورم باستخدام الفرجار كل يوم. احسب حجم الورم (مم³) ك (الطول × العرض²) / 2. عندما يصل حجم الورم إلى حوالي 200 مم³ في الحجم ، ابدأ التجربة.
2. دراسة الفعالية المضادة للسرطان
   1. قسم الفئران بشكل عشوائي إلى 4 مجموعات (ن = 10 لكل مجموعة).
   2. تخدير الفئران بحقن الزيلازين ومزيج من التيلتامين والزولازيبام (1: 2 ، 1 مل / كغم). تأكد من التخدير المناسب عن طريق الضغط برفق على طية صغيرة من جلد الفأر. استخدم مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
      ملاحظه: إذا لم يتم ملاحظة أي حركة ، يتم تخدير بدرجة كافية لبدء التجارب.
   3. قم بإذابة الجسيمات النانوية في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 2 مجم / مل HB. حقن PBS أو HB الحر أو HB-NPs أو HB-P-NPs عبر الوريد الذيل (2 مجم / كجم مثل HB) مرتين في اليومين 0 و 7.
   4. استمر في مراقبة الفئران حتى تبدأ في التحرك حول القفص.
      ملاحظه: لا تترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. لا تعيد الذي خضع لعملية جراحية إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما. حافظ على الأقفاص مظلمة وتحت ظروف SPF محددة.
   بعد
   5. 24 ساعة من كل حقنة، قم بتخدير الفئران بحقن الإيجازين ومزيج من التيتيلامين والزولازيبام (1: 2، 1 مل/كغ). تأكد من التخدير المناسب عن طريق الضغط برفق على طية صغيرة من جلد الفأر. استخدم مرهما بيطري على العينين لمنع الجفاف أثناء التخدير.
      ملاحظه: إذا لم يتم ملاحظة أي حركة ، يتم تخدير بدرجة كافية لبدء التجارب.
   6. ضع موقع الورم تحت ألياف PDT (بمسافة 1 سم من ألياف PDT إلى الورم). ارتد نظارات السلامة بالليزر ، وقم بإيقاف تشغيل المفتاح ، وقم بإضاءة الورم باستخدام ليزر PDT (630 نانومتر ، 400 ميجاوات / سم²) لمدة 500 ثانية (200 جول / سم²) مرتين في اليومين 1 و 8.
   7. استمر في مراقبة الفئران حتى تبدأ في التحرك حول القفص. لا تترك دون رقابة حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي. لا تعيد الذي خضع لعملية جراحية إلى صحبة الأخرى حتى يتعافى تماما.
   8. احتفظ بالأقفاص تحت ظروف عامل حماية من الشمس. حافظ على الأقفاص في الظلام لمدة 24 ساعة بعد العلاج بالليزر.
   9. راقب حجم الورم والتغيرات في موقع الورم بصريا كل يوم. قم بقياس حجم الورم باستخدام الفرجار ، واحسب الحجم على أنه (الطول × العرض²) / 2 (مم³). التقط صورا لمواقع الورم كل يوم للتحقق من وجود تغيرات في سطح الورم بعد PDT.
   10. في اليوم 16 ، قم بالتضحية بخمسة فئران لكل مجموعة عن طريق التخدير النهائي باستخدام الأيزوفلوران.
   11. باستخدام الملقط والمقص ، قم بقطع الجلد الخارجي وفضح الأورام. احصدها بعناية. قم بإصلاحها في 10٪ فورمالين ، وقم بتضمينها في البارافين ، ولطخها بالهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) للتحليل النسيجي.
   12. بعد 45 يوما من المراقبة ، ضحي بالفئران المتبقية عن طريق التخدير النهائي باستخدام الأيزوفلوران.

المواد