تطعيم جزر البنكرياس: طريقة لزرع جزر البنكرياس في الغرفة الأمامية لعين الفأر للتصوير في الجسم الحي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Nilsson، J.et. al. تصوير طولي في الجسم الحي وتقدير كمية لتطعيم جزيرة البنكرياس البشرية والمساهمة في الخلايا المضيفة في غرفة العين الأمامية. J. Vis. Exp. (2020).

يصف هذا الفيديو بروتوكول تطعيم جزر البنكرياس البشرية في الغرفة الأمامية لعين الفأر لمراقبة إعادة توعية الطعوم الجزرية البشرية في الجسم الحي. كما أنه يساعد على فهم مساهمة الخلايا المتلقية مقابل الخلايا المانحة في تعزيز تغليف والأوعية الدموية للطعم.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية في Jove

< p class = "jove_title" >1. تحضير معدات الزرع وجدول الجراحة

ملاحظة: يجب تعقيم جميع الأدوات الجراحية ، وتطهير طاولة الجراحة والأدوات بالكحول بنسبة 70٪.

1. قم بتوصيل حامل الرأس التجسيمي بالتخدير عبر قناع الأنف وقم بتشغيل وسادة التدفئة.
2. قم بتوصيل حقنة هاميلتون محكمة الغلق بأنابيب البولي إيثيلين وقنية العين ذات النهاية الحادة.
   ملاحظه: يوصى بملء جميع الأجزاء ب PBS قبل التجميع. تحقق من وجود فقاعات هواء محتجزة وقم بإزالتها إذا كانت موجودة.
3. قم بتوصيل حقنة هاميلتون بإحكام بالطاولة (الشكل 1 أ) أو قاعدة متحركة (الشكل 1 ه) وقم بتوصيل الأنبوب بالمجهر الاستريو ، مع تعليق القنية لأسفل (أي وضع الانتظار).
   ملاحظه: استخدم شريطا جراحيا ، لأنه سهل إزالته وإعادة توصيله.
4. قم بإعداد حقنة سعة 1 مل متصلة بإبرة 30 جم مملوءة بمحلول بوبرينورفين 0.1 مجم / كجم.
5. تحضير حقنة مع PBS معقمة. بدلا من ذلك، استخدم ماصة.
6. ضع جانبا قفصا نظيفا للاستيقاظ مع مصباح تدفئة.

2. تخدير ووضع الفئران المتلقية للجراحة

ملاحظة: تم تربية جميع وصيانتها في بيئة خالية من مسببات الأمراض في مرافق في جامعة لوند.

1. قم بتخدير الماوس في غرفة مملوءة ب 40٪ O₂/60٪ N₂/3٪ isoflurane وانقل الماوس المخدر إلى منصة حامل الرأس على وسادة تسخين دافئة (الشكل 1 أ). تحقق من عدم وجود ردود أفعال الدواسة.
   ملاحظه: تخدير الأيزوفلوران هو طريقة التخدير المفضلة للتعافي السريع بعد الجراحة. يجب تهوية غرفة المجهر بشكل صحيح لاستخدام الأيزوفلوران.
2. ضع أنف الفأر في قناع التخدير المتصل بجهاز تخدير الأيزوفلوران 40٪ O₂ / 60٪ N₂ 0.9٪ -1.5٪. استخدم الإبهام والإصبع لرفع الرأس لأعلى قليلا وربطه باستخدام القطع المعدنية على الجانبين. تأكد من أن سماعات الأذن تثبت الرأس أسفل الأذنين مباشرة. حقن 0.1 مجم / كجم من محلول البوبرينورفين تحت الجلد على الجزء الخلفي من الفأر.
   ملاحظه: يستخدم البوبرينورفين كمسكن.
3. قم بإمالة الرأس بحيث تكون العين المراد إجراء العملية عليها متجهة لأعلى وقريبة من الباحث.
4. اسحب جفون العين المراد زراعتها برفق باستخدام ملقط حاد ، ثم اخرج العين للخارج ، وثبته بشكل فضفاض باستخدام زوج من الملقط. تأكد من تغطية أطراف الملقط بأنبوب بوليثين متصل بمنصة حامل الرأس (الشكل 1 أ ، داخلي).
5. حافظ دائما على كلتا العينين مبللتين عن طريق وضع قطرة من PBS المعقم على العين.
6. انقل الجزر البشرية من الأنبوب المختوم سعة 1.5 مل (القسم 1) إلى طبق بتري مع PBS معقم وتأكد من أن الجزر قريبة من بعضها البعض لتقليل كمية وسائط زراعة الخلايا المنقولة (الشكل 1 ج).
7. التقط ~ 20-30 جزيرة صغيرة في قنية العين المتصلة عبر أنابيب البوليثين بحقنة هاميلتون.
   ملاحظه: تناول أقل قدر ممكن من السوائل مع الجزر.
8. قم بتعليق الأنبوب رأسا على عقب وقم بتوصيله بالمجهر الاستريو (الشكل 1 د). قم بلصق الأنبوب بعناية للسماح للجزر بالغرق في نهاية الأنبوب باتجاه القنية.

< ص الفئة = "jove_title" >3. إجراء الزرع

ملاحظة: تم وصف هذه الطريقة مسبقا لزرع جزر الفئران. يتم تقديم إجراء معدل قليلا هنا.

1. اضغط على الوسادات على الأرجل الخلفيتين للتأكد من أن الماوس نائم.
2. شد الملقط الذي يقيد العين دون تعطيل تدفق الدم وقم بتطبيق قطرة من PBS المعقم على العين.
3. باستخدام إبرة 25 جم كمشرط ، قم بشطبة لأعلى ، واخترق بعناية نصف الطرف في القرنية وقم بعمل شق جانبي واحد. اصنع الثقب بزاوية تصاعدية ؛ سوف يغلق الثقب بسهولة أكبر بعد الزرع (الشكل 1 و).
4. ارفع القرنية بحذر باستخدام القنية المحملة مسبقا بالجزر الصغيرة وقم بتطبيق الجزر الصغيرة ببطء في العين. تجنب إدخال القنية في الغرفة الأمامية لمنع تلف القزحية ، ولكن بدلا من ذلك ادفع بعناية ضد فتحة القرنية (الشكل 1 ز). اسحب القنية ببطء من ACE.
   ملاحظه: تهدف إلى حجم حقن يتراوح بين 3 و8 ميكرولتر. إذا كان الحجم كبيرا جدا ، فسوف يعرض العين لضغط مرتفع داخل العين بشكل غير ضروري وقد يؤدي إلى ارتجاع الجزر المحقونة خارج الغرفة الأمامية.
5. عند مواجهة صعوبات في إدخال الجزر بسبب زيادة الضغط في حجرة العين ، قم بتوسيع موقع الشق عن طريق تقوية موقع الشق الجانبي وإعادة تطبيق الجزر.
   ملاحظه: في بعض الأحيان ، يمكن استخدام فقاعات الهواء المقدمة كحاملات مساحة.
6. ضعي جل العين على العين ، وفك ملقط تقييد العين واتركي الفأر على الأيزوفلوران في نفس الوضع لمدة 8-10 دقائق للسماح للجزر بالتماسك.
7. قم بإزالة الملقط الذي يحمل الجفن وأعد الجفن إلى وضعه الطبيعي.
8. قم بإزالة الماوس من حامل الرأس وانقله إلى قفص الاستيقاظ.
9. عندما يكون الفأر مستيقظا ويتحرك ، انقله مرة أخرى إلى القفص الأصلي واحتفظ به في سكن حتى المسح الضوئي (يوصى ب 5 أيام على الأقل).

النتائج

الشكل 1: زرع جزر البنكرياس في الغرفة الأمامية للعين.< / > (أ) إعداد الزرع يظهر الفأر المخدر المثبت في حامل الرأس التجسيمي والعين المكشوفة (الداخلية) بجوار حقنة هاميلتون المعدة المثبتة على الطاولة والمجهر المجسم جاهز لالتقاط جزر الفأر (ب) أو الجزر البشرية (ج). (د) وضع انتظار قنية العين المحملة بالجزر الصغيرة. (ه) عملية الزرع قيد التنفيذ ، و (و) الرسم التخطيطي لش...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات معطف مقعد نظيف وسادة التدفئة اضبط على 37 درجة مئوية جهاز تصوير Ivis Lumina ll Bioluminescent الفرجار تشمل أنظمة التصوير البديلة للإضاءة الحيوية In vivo F PRO (Carestream) و Photon Imager (Biospace Lab) تشريح مقص ملقط القزحية (مسننة) حامل إبرة 27 جم 0.3 مل حقنة أنسولين تيرومو T35525M2913