التثقيب الكهربائي العضوي: طريقة لنقل الحمض النووي البلازميد إلى عضيات الجهاز الهضمي

الملخص

المصدر: Gaebler ، A. M.et al.بروتوكول التثقيب الكهربائي العالمي والفعال للهندسة الوراثية للعضيات المعدية المعوية. J. Vis. Exp. (2020).

يصف هذا الفيديو بروتوكول التثقيب الكهربائي لنقل البلازميدات الكبيرة إلى عضيات الجهاز الهضمي ثلاثية الأبعاد لإثبات وظيفتها العالمية في كيانات مختلفة ، وهي السرطان الغدي الأقنية البنكرياسي (PDAC) ، وسرطان القولون والمستقيم (CRC) ، وسرطان القنوات الصفراوية (CCC) ، وسرطان المعدة (GC).

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الثقافة العضوية والمستحضرات قبل التثقيب الكهربائي

1. إنشاء العضيات عن طريق هضم الأنسجة كما هو موضح سابقا وتوسيعها مع وسيط الثقافة الخاص بالكيان المقابل لها في نظرة عامة على مصفوفة الطابق السفلي انظر الجدول 1 وجدول المواد
   ملاحظه: بالنسبة لعينات الأنسجة البشرية ، من الضروري الموافقة المستنيرة والموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقية.
قم
2. بتسخين ألواح 48 بئرا عند 37 درجة مئوية للبذر بعد التثقيب الكهربائي.
3. تحضير الوسط القاعدي بدون المضادات الحيوية بالإضافة إلى وسط زراعة العضيات الخاص بالكيان بدون المضادات الحيوية (انظر الجدول 1) بما في ذلك 10 ميكرومتر Y-27632 و 3 ميكرومتر CHIR99021.
   ملاحظه: سحب المضادات الحيوية مهم لتقليل الآثار السامة. Y-27632 و CHIR99021 يحسنان استعادة الخلايا.
4. تحضير العضيات (انظر الشكل 1)
   1. زرع 5 آبار من العضيات في صفيحة 48 بئرا لكل عينة تثقيب كهربائي في وسط الاستزراع.
      ملاحظه: يجب استخدام العضيات التكاثرية (حوالي 2-3 أيام بعد آخر انقسام).
   2. قم بإعداد 230 ميكرولتر من كاشف التفكك (انظر جدول المواد) بما في ذلك 10 ميكرومتر Y-27632 لكل بئر.
   3. قم بإزالة وسط الاستزراع من كل بئر وفصل العضيات ميكانيكيا في 230 ميكرولتر من خليط التفكك المحضر. تجمع 5 آبار لكل عينة كهربائية في أنبوب واحد سعة 15 مل.
   4. تخلط عن طريق الدوامة وتحتضن لمدة 5-15 دقيقة عند 37 درجة مئوية حتى تحدث مجموعات من 10-15 خلية. لذلك ، تحقق من التفكك مجهريا. أوقف عملية الهضم عن طريق إضافة وسط قاعدي بدون مضادات حيوية حتى 10 مل
      ملاحظه: هذه الخطوة حاسمة للغاية! سيتم تقليل كفاءة التثقيب الكهربائي ، عندما تكون الحضانة قصيرة جدا ، لكن الهضم الطويل سيقلل من القدرة على البقاء على قيد الحياة.
   5. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية واغسلها مرتين ب 4 مل من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي (انظر جدول المواد).

< p class = "jove_title" >2. التثقيب الكهربائي

< p class = "jove_content" >ملاحظة: تم تطوير البروتوكول التالي للمثقافات الكهربائية القادرة على الموجات المربعة وتسلسل نبضات الحفر والنقل المنفصل (انظر الشكل 2). اختياريا ، يمكن قياس قيم المعاوقة بالإضافة إلى الفولتية والتيارات والطاقات المنقولة إلى العينة كعنصر تحكم في التجارب القابلة للتكرار.

1. أعد تعليق الحبيبات العضوية في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي (انظر جدول المواد) الذي يحتوي على 30 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد.
   ملاحظه: يجب أن يتجاوز تركيز الحمض النووي البلازميد المستخدم 5 ميكروغرام / ميكرولتر للحصول على تركيز مثالي للملح أثناء عملية التثقيب الكهربائي. لذلك ، يوصى باستخدام مجموعات البلازميد الماكسي الحرة (انظر جدول المواد) لإعداد النواقل. يمكن استخدام كمية إجمالية تصل إلى 45 ميكروغرام من الحمض النووي دون تأثيرات سامة للخلايا.
2. قم بتوزيع خليط الحمض النووي العضوي الكامل في كوفيت كهربائي بعرض فجوة 2 مم دون إنتاج فقاعات هواء.
3. اضبط معلمات التثقيب الكهربائي (انظر الجدول 2 ، الشكل 2).
4. امزج الخلايا قليلا دون رغوة عن طريق النقر على الكوفيت بإصبع. ضع الكوفيت في حجرة الكوفيت.
5. اضغط على زر Ω الخاص بجهاز الاختراق الكهربائي وقم بتدوين قيمة المعاوقة.
   ملاحظه: أظهرت المعاوقة بين 30-40 Ω أفضل النتائج. بشكل عام ، يجب أن يكون في النطاق بين 30-55 Ω. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فيرجى التحكم في الجوانب التالية: عرض الفجوة في الكوفيت المستخدم ، وتوصيلات الكابلات للجهاز الكهربائي ، وفقاعات الهواء المحتملة ، والحجم الصحيح وتركيز الملح لخليط التثقيب الكهربائي.
6. اضغط على زر البدء لتنفيذ برنامج التثقيب الكهربائي والتحكم في قيم التيارات والفولتية والطاقات المعروضة.
   ملاحظه: يجب أن تتوافق قيم الفولتية والتيارات والطاقات المقاسة مع معلمات التثقيب الكهربائي المحددة. لمقارنة التجارب المتكررة ، قد يكون من المفيد ملاحظة هذه البيانات.
7. بعد التثقيب الكهربائي ، أضف على الفور 500 ميكرولتر من وسط المزرعة بدون المضادات الحيوية (مع CHIR99021 و Y-27632 ؛ انظر الخطوة 1.3). امزج عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل لفصل الرغوة البيضاء.
   ملاحظه: تظهر الرغوة البيضاء بعد عملية التثقيب الكهربائي ويتم إرفاق عدد كبير من الخلايا بها. لذا ، فإن تفكيكه مهم جدا لعدم فقدان الخلايا.
8. انقل العينة بالكامل من الكوفيت إلى أنبوب جديد سعة 15 مل باستخدام الماصة التي تنتمي إلى كوفيتات التثقيب الكهربائي (انظر جدول المواد). يوصى بشطف الكوفيت مرة أخرى بالوسط القاعدي للحصول على الخلايا المتبقية.
9. لتجديد الخلايا ، احتضنها لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

< p class = "jove_title" >3. بذر الخلايا

قم
1. بالطرد المركزي للخلايا عند 450 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية.
2. أعد تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من مصفوفة الطابق السفلي وقم ببذور 20 ميكرولتر قطرات في صفيحة 48 بئرا مسخنة مسبقا (انظر الخطوة 1.2). احتضن لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية للبلمرة وأضف 250 ميكرولتر من وسط الاستزراع ، والذي يتم استكماله ب Y-27632 و CHIR99021 حتى الانقسام التالي للعضيات المزروعة (حوالي 5-7 أيام).

< p class = "jove_title" >4. تحديد كفاءة التعدي

ملاحظة: بشكل عام ، يوصى بالكهرباء متجه يحمل علامة مضان كتحكم إضافي في التعدين. اعتمادا على العلامة المختارة ونضج الكروموفور ، سيكون التألق مرئيا في غضون 24-48 ساعة بعد التعدي 18.

1. افحص التألق مجهريا بعد 24-48 ساعة في التحكم في التعدي (الشكل 3 ب)

< p class = "jove_content" >الجدول 1: تكوين الوسط القاعدي ومخاليط الهضم ووسائط الزراعة.

المكونات المتوسطة القاعدية: أنا الثاني متقدم DMEM / F-12 - - جلوتاماكس 1x 1x هيبس 10 ملم 10 ملم البنسلين ستربتومايسين - 1x بريموسين 1x - التأسيس عن طريق الهضم مزيج الهضم: القولون المعدة الكبد البنكرياس عادي ورمي عادي ورمي عادي ورمي عادي ورمي كولاجيناز الثاني - - - - - 0.625 مجم / مل كولاجيناز الحادي عشر - 0.1 ملغ/مل - 0.1 ملغ/مل - - كولاجيناز د - - - - < TD Colspan = "2" >2.5 مجم / مل - Dispase II - 1 ملغ/مل - 1 ملغ/مل - < TD Colspan = "2" >2.5 مجم / مل DNase I - - - - 0.1 مجم / مل - EDTA 2 مللي - 10 مللي متر - - - مخفف في المخزن المؤقت المخلب* متوسط القاعدي I المخزن المؤقت المخلب* متوسط القاعدي I في EBSS المتوسط القاعدي I حضانة ل: 0.5 ساعة على الجليد 1 ساعة عند 37 درجة مئوية 0.25-0.5 ساعة في RT 1 ساعة عند 37 درجة مئوية 0.5-1 ساعة عند 37 درجة مئوية 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية 0.5-1 عند 37 درجة مئوية 2-3 ساعات عند 37 درجة مئوية مقتبس من المرجع: ساتو وآخرون 2011 Bartfeld et al. 2015 Broutier et al. 2016 Hennig et al. 2019 وسط الزراعة (أساسي: الوسط القاعدي II) أ 83-01 0.5 ميكرومتر 2 ميكرومتر 5 ميكرومتر 0.5 ميكرومتر ب 27 1x 1x 1x 1x ب 27 بدون فيتامين أ - - 1x - فورسكولين - - 10 ميكرومتر - hFGF-10 - 200 نانوغرام / مل 100 نانوغرام / مل 100 نانوغرام / مل hHGF - - 25 نانوغرام / مل - [ليو15] جاسترين 10 نانومتر 1 نانومتر 10 نانومتر 10 نانومتر mEGF 50 نانوغرام / مل 50 نانوغرام / مل 50 نانوغرام / مل < TD Colspan = "2" >50 نانوغرام / مل N2 - - 1x - 1x ن-أسيتيل-L-سيستين 1.25 ملي 1 ملي متر 1 ملي متر 1 ملي نيكوتيناميد 10 ملم 10 ملم 10 ملم 10 ملي متر راس 10 ٪ 10 ٪ - 10٪ بريموسين 1x (100 ميكروغرام / مل) 1x (100 ميكروغرام / مل) 1x (100 ميكروغرام / مل) 1x (100 ميكروغرام / مل) البروستاجلاندين E2 10 نانومتر - - - 1 ميكرومتر رسبوندين 20 ٪ 10 ٪ 10 ٪ 10٪ SB202190 3 ميكرومتر - - - Wnt3A 50 ٪ 50 ٪ - 50٪ * المخزن المؤقت المخلبي: 5.6 ملي Na₂HPO₄ ، 8.0 ملي مولار KH₂PO₄ ، 96.2 ملي كلوريد الصوديوم ، 1.6 ملي كلوريد كلوريد ، 43.4 ملي سكروز ، 54.9 ملي مولار د-سوربيتول ، 0.5 ملي ديسيلتر ديثيوثريتول في الماء المقطر

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: سير عمل إعداد التثقيب الكهربائي. أولا ، يجب فصل العضيات إلى مجموعات من 10-15 خلية ويجب غسل المضادات الحيوية. بعد التثقيب الكهربائي ، يجب فصل الرغوة البيضاء. يمكن زرع الخلايا بعد التجدد لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات [ليو15] جاسترين سيجما ألدريتش جي 9145 أ 83-01 توكريس بيوساينس 2939 متقدم DMEM / F-12 إنفيتروجين 12634010 ب 27 إنفيتروجين 17504044 مكمل B27 ، ناقص فيتامين أ ثيرمو فيشر العلمي 12587010 CHIR99021 ستيمجنت 04-2004 كولاجيناز الثاني تقنيات الحياة 17101-015 كولاجيناز الحادي عشر سيجما ألدريتش سي 9407-100 ملغ كولاجيناز د روش 11088866001 Dispase II روش 4942078001 دناسي الأول سيجما ألدريتش د5319 د-سوربيتول روث 6213.1 ديثيوثريتول الترمو: العلمية 1859330 EDTA روث 8040 فورسكولين توكريس بيوساينس 1099 جلوتاماكس تقنيات الحياة 35050061 هيبس ثيرمو فيشر العلمي 15630106 hFGF-10 بريبروتك 100-26 كيه سي إل سيجما ألدريتش ص 9541 كيه 2 ب 4 روث 3904.2 ماتريجيل كورنينج 356231 مصفوفة الطابق السفلي mEGF إنفيتروجين PMG8043 N2 إنفيتروجين 17502048 كلوريد الصوديوم روث 3957.1 Na2HPO4 روث ك 300.2 ن-أسيتيل-L-سيستين سيجما ألدريتش أ 9165 نيكوتيناميد سيجما ألدريتش N0636 راس ن. ن. وسط مكيف منتج من خلايا HEK293 (Hek293- mNoggin-Fc) HGF البشري المؤتلف بريبروتك 100-39 ساعة رسبوندين ن. ن. وسط مكيف منتج من خلايا HEK293 (HA-Rspo1- Fc-293T) SB202190 سيجما ألدريتش إس 7067 تريبل إكسبريس جيبكو 12604021 كاشف التفكك Wnt3A ن. ن. وسط مكيف منتج من خلايا L-Wnt3a (من سيلفيا بوج) Y-27632 سيجما ألدريتش Y0503 48 بئر لوحة كورنينج 3548 نيبا أكواف التثقيب الكهربائي 2 مم مع ماصات شركة نيبا جين المحدودة EC-002S المثقب الكهربائي Nepa21 شركة نيبا جين المحدودة ن. ايفوس فلوريدا أوتو إنفيتروجين AMAFD1000 المجهر الفلوري EndoFree بلازميد ماكسي كي كياجين هاتف 12362 أوبتي-ميم جيبكو 31985047 المخزن المؤقت للتثقيب الكهربائي 2 ناقلات الحمض النووي الريبي المتجدد أدجين 84879 PX458 بلازميد أدجين هاتف: 48138 ترميز sgRNA و Cas9 px458_Conc2 البلازميد أدجين 134449 px458 البلازميد الذي يحتوي على 2x U6 promotors لاثنين من sgRNAs المختلفين