تصوير ديناميكيات الكالسيوم في خلايا البنكرياس: تقنية لدراسة التغيرات في الوقت الفعلي في تركيز الكالسيوم العصاري الخلوي في جزيرة البنكرياس

الملخص

المصدر: Hamilton، A.، et. al. تصوير ديناميكيات الكالسيوم في مجموعات سكانية فرعية لخلايا جزيرة البنكرياس في الفئران. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تقنية تصوير خلايا الجزيرة في الوقت الفعلي ، لدراسة التغيرات في تركيز الكالسيوم العصاري الخلوي في المجموعات السكانية الفرعية الثانوية لخلايا جزيرة البنكرياس. يمكن تحديد المجموعات السكانية الفرعية للخلايا الثانوية باستخدام الاستجابات الوظيفية لمركبات العلامات ، مثل الأدرينالين والجريلين ، التي تحفز تغييرات في الكالسيوم العصاري الخلوي في مجموعات معينة من خلايا الجزر. يمكن أن يوفر هذا نظرة ثاقبة للحديث المتبادل بين جلوكوز الدم وإخراج إفرازات الجزيرة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. قم بتحميل الصبغة أو التعبير عن المستشعر

1. تحضير الصبغة القابلة للاحتجاز.
   1. قم بإذابة الكمية (عادة ، 50 ميكروغرام) من الصبغة القابلة للاحتجاز (على سبيل المثال ، Fluo-4) في DMSO إلى تركيز مخزون يبلغ 2 مليمتر. أضف حمض البلورونيك إلى التركيز النهائي بنسبة 1٪ (باستخدام مخزون 20٪ في DMSO) ، لتحسين إذابة الصبغة.
   2. Aliquot الصبغة في أنابيب PCR صغيرة (2 ميكرولتر في كل منها). يمكن تخزين الصبغة مجمدة (-20 درجة مئوية) لعدة أسابيع.
2. بدلا من ذلك ، قم بإعداد المستشعر المؤتلف.
   1. قم بتوزيع المستشعر (على سبيل المثال ، ناقلات الفيروسات الغدية التي تشفر GCaMP6f) إلى 10 ميكرولتر وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
   2. (اختياريا) قم باختبار عيار المخزون الفيروسي مسبقا عن طريق إصابة الجزر الصغيرة (على النحو التالي) باستخدام عدة تخفيفات تسلسلية ، للكشف عن التركيز الأمثل للعدوى.
      ملاحظه: تتطلب المستشعرات المؤتلفة المشفرة بواسطة نواقل مختلفة (فيروس العدسات ، BacMam ، AAV) بروتوكول عدوى مختلف. تأكد من التحقق من ذلك مع مزود المتجهات وتحسين نسبة العمل لاحتياجاتك. يمكن تخزين المخزون "العامل" للفيروس الغدي عند -20 درجة مئوية وتجميده / إذابته عدة مرات. يقلل الدوران المفرط بالتجميد والذوبان من العيار الفعال للفيروس.
3. تحضير محلول التصوير.
   1. اصنع محلول التصوير ، ملليمتر: 140 كلوريد الصوديوم ، 4.6 كلوريد كلوريد ، 2.6 كلوريد_{المكلون 2} ، 1.2 ملجمكلوريد₂ ، 1 هيدروكسيد الصوديوم₂، 5 هيدروكسيد الصوديوم₃ ، 10 هيدروكسيد الصوديوم (درجة الحموضة 7.4 ، مع هيدروكسيد الصوديوم).
   2. اصنع مخزونا من الجلوكوز (0.5 م) ومانيتول (0.5 م) في محلول التصوير. يمكن تخزين المرق في الثلاجة (4 درجات مئوية) لعدة أسابيع.
4. قم بتحميل الصبغة القابلة للاحتجاز.
   1. قم بتكوين محلول عمل الصبغة عن طريق إذابة 2 ميكرولتر من الصبغة في 600 ميكرولتر من محلول التصوير الذي يحتوي على 6 ملي مولار من الجلوكوز. يمكن تسخين المحلول أو دوامه لتحسين الذوبان.
   2. قم بتحميل الجزر المعزولة في محلول عمل الصبغة. يمكن أن يتم التحميل باستخدام صفيحة متعددة الآبار أو طبق بتري. في الحالة الأخيرة ، ضع قطرة 100 ميكرولتر من محلول العمل في قاع طبق بتري غير لاصق (35 أو 60 مم) وماصة 10-30 جزيرة في القطرة.
   3. في حالة وجود مجموعات مختلفة من الجزر الصغيرة (مثل النوع البري / الضربة القاضية) ، قم بترتيب آبار متعددة وقطرات متعددة بحيث يمكن التحميل في وقت واحد.
   4. احتضان الجزر الصغيرة في محلول عمل الصبغة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 70-90 دقيقة. لا تفرط في الحضانة.
   5. تحقق من التحميل تحت المجهر الفلوري ؛ يجب أن تكتسب الجزر الجزر مضان خفيف ، مع بعض الخلايا أكثر إشراقا من البقية. تقريب الخلايا والتوطين النووي للصبغة هي علامات على التحميل الزائد.
   6. انقل الجزر إلى محلول تصوير خال من الصبغة يحتوي على 6 ملي مولار جلوكوز. يمكن استخدام الجزر الصغيرة للتصوير على الفور ، ولكن اختياريا يمكن ترك الصبغة لإزالة الأسترة لمدة 10-15 دقيقة أخرى. ستحتفظ الجزر بالصبغة لعدة ساعات وبالتالي يمكن استخدامها للتصوير في عدة نوبات.
5. بدلا من ذلك ، تصيب الجزر بالناقل المؤتلف.
   1. قم بوضع الجزر الصغيرة في قطرات في وسط زراعة RPMI (RMPI1640 (انظر جدول المواد) ، مكملة بنسبة 10٪ من مصل ربلة الساق الجنينية ، 100 وحدة / مل من البنسلين ، 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين. قم بتوزيع الوسيط في طبقين بلاستيكيين بتري مقاس 60 مم (غير معالج بأي مادة لاصقة) ، واحتفظ بالأطباق في الحاضنة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ ، الرطوبة المطلقة)). (على سبيل المثال ، 30 ميكرولتر) ، لتقليل حجم المتجه المطلوب.
   2. أضف الناقل بنسبة 10 5 وحدات معدية تقريبا/جزيرا من شأنها أن تؤدي بشكل مثالي إلى تعدد العدوى >2. من الناحية المثالية ، يجب تحسين النسبة إلى الحد الأدنى من النسبة التي من شأنها أن توفر التعبير في الطبقة الطرفية. قد يساعد المعايرة بالتحليل الحجمي المسبق (الخطوة 1.2.2).
   3. أدخل 20-50 جزيرة صغيرة في القطرات والثقافة لمدة 8-48 ساعة. (من الناحية المثالية ، بين عشية وضحاها). يجب أن تتطور الجزر إلى تألق أخضر باهت في معظم الخلايا ، دون تغييرات في مورفولوجيا الخلية.
      ملاحظه: يعتمد نجاح العدوى والتعبير على وقت التعرض لمحلول الفيروس. من الناحية المثالية ، يجب أن يبقى الفيروس في المحلول طوال الليل ولكن يمكن إزالته اختياريا بعد أقل من 15 دقيقة. ومع ذلك ، من المرجح أن تكون العدوى ، وبالتالي التعبير ، أقل بشكل كبير.

فئة

2. ديناميكيات التصوير Ca^{2 +}

1. شل حركة الجزر الصغيرة تحت المجهر (المقلوب).
   1. قم بتجميع غرفة التصوير للفحص المجهري المقلوب. ضع الغطاء الزجاجي (السماكة 1 أو 1.5) داخل الغرفة وتأكد من أن واجهة الغرفة الزجاجية محكمة الإحتى. تحقق من أن الغطاء في متناول هدف المجهر (أمر بالغ الأهمية لحالة هدف NA المرتفع الضخم).
   2. تحضير ملحقات الشلل. قطع مستطيلات صغيرة (20 مم × 20 مم) من الشبكة الدقيقة والشبكة الخشنة. أدخل "جدارين" فاصلين على الشبكة الدقيقة باستخدام شريط لاصق بسمك 45-50 ميكرومتر. استخدم طبقات مزدوجة من الفاصل إذا كان حجم الجزر المراد تصويرها يتجاوز بشكل كبير 100 ميكرومتر التقليدية.
   3. اغمر الشبكات والوزن في محلول التصوير باستخدام طبق بتري مقاس 35 مم. تأكد من أن البلاستيك والمعدن مبللان.
   4. تحت مجهر التشريح ، اقلب الشبكة الدقيقة مع "جدران" الفاصل رأسا على عقب ، بحيث تكون الفواصل متجهة لأعلى. اختر العديد من الجزر المحملة بالصبغة القابلة للاحتباس أو شفط عن المستشعر المؤتلف بماصة P20 وضعها برفق فوق الشبكة الدقيقة ، بين الفواصل الفاصلة. تأكد من أن الشبكة والغسالات لا تحتوي على كميات زائدة من محلول التصوير عليها.
   5. التقط الشبكة بالجزر الصغيرة ، باستخدام ملقط صانع الساعات ، وضعها رأسا على عقب داخل غرفة التصوير ، بحيث تكون الفواصل متجهة لأسفل وتجلس مباشرة على غطاء الغرفة. تأكد من أن الجزر محاصرة بين الفواصل والشبكة ، في منتصف الغطاء.
   6. ضع الشبكة الخشنة والوزن أعلى الشبكة الدقيقة داخل الغرفة. أدخل محلول التصوير في الغرفة. تأكد من أن الجزر الجزرية مجمدة وجاهزة للتصوير. تجنب الاهتزاز المفرط للغرفة (الاضطرابات الصغيرة مثل حمل الغرفة إلى المجهر وإدخالها في مرحلة ساخنة مقبولة).
      ملاحظه: يمكن تطبيق ترتيب تثبيت مماثل لنظام عمودي.
2. قم بإعداد المجهر.
   1. اختر وضع التصوير والهدف ، ضع الغرفة مع الجزر الصغيرة من الخطوة 2.1 في مرحلة التحكم في درجة الحرارة في المجهر.
      1. اضبط التحكم في درجة الحرارة (من الناحية المثالية ، بين 30 درجة مئوية و 36 درجة مئوية) والتروية. بالنسبة للنظام المقلوب ، ضع التدفق الداخل أقل من التدفق الخارج داخل الغرفة ، واضبط تدفق التدفق ليكون أكبر من تدفق التدفق الداخل (والذي يتم تحقيقه عادة باستخدام أنبوب بقطر داخلي أوسع على مضخة تمعجية).
      2. تأكد من أن التدفق الخارجي له حد أدنى من سطح التلامس مع المحلول ، بحيث يزيل المحلول في قطرات صغيرة متسلسلة متعددة ، وتجنب فترات طويلة من الإزالة المستمرة للمحلول. هذا الأخير هو المصدر الرئيسي للقطع الأثرية في التصوير بفاصل زمني للإشارات الدورية حيث تظهر على شكل تذبذبات دورية منتظمة للكثافة لكل بكسل مصور وكثيرا ما يتم تفسيرها على أنها "موجات بطيئة".
      3. بدء التروية بمحلول التصوير الذي يحتوي على 3 ملي مولار من الجلوكوز.
   2. اختر مسار الضوء والمرشحات لتصوير الفلوروفورات الخضراء ؛ الإثارة بين 470 و 500 والانبعاث بين 505 و 550 ستعمل لكل منها.
   3. قم بتشغيل التصوير المباشر لإعداد معلمات التصوير. اضبط العرض لالتقاط الجزر الصغيرة ذات الأهمية.
   4. تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء للصورة. تحقيقا لهذه الغاية ، اضبط شدة ضوء الإثارة ووقت التعرض والتجميع تأكد من أن الإعدادات تسمح بتصور مميز لكل خلية داخل الجزيرة بأقل قدر ممكن من شدة الضوء والتعرض.
   5. إجراء الحصول على الصور. اعتمادا على المهمة ، يمكن التقاط الصور من 0.1 إلى 5 هرتز. هذا أقل بكثير من معايير Nyquist للتذبذبات السريعة التي تحركها Na ⁺ في الخلايا α و δ (>300 هرتز) ، مما يعني أن البيانات أقل من العينات بشكل افتراضي. ومع ذلك ، فإن زيادة تواتر الاستحواذ ليتناسب مع هذا الطلب غير ممكن في التصوير متعدد الخلايا / متعدد الجزر مع مجال رؤية كبير. يمكن تصوير GCaMP بشكل أسرع ، في حين أن Fluo4 سوف يبيض بشكل لا مفر منه في ظل ظروف الاستحواذ السريع.
      ملاحظه: بالنظر إلى أن تذبذبات _{الخلايا} [Ca^{2 +}] في خلايا الجزر مدفوعة بالنشاط الكهربائي ، فإن استخدام معدلات اكتساب منخفضة قد يبدو عكسيا. ومع ذلك ، في الواقع ، قد تكون معدلات الاستحواذ عند حوالي 1 هرتز أو أعلى كافية لحل سلوك ارتفاع الخلايا β ، في حين أن عتبة الكشف عن التذبذبات التي تحركها قناة الصوديوم في الخلايا α و δ أعلى بكثير من 300 هرتز. سواء تم الحصول على تذبذبات _{الخلايا} α أو δ الخلية [Ca^{2 +}] عند 1 هرتز أو 0.1 هرتز ، أخذ عينات أقل من العينات بشدة وتعكس معالجة Ca²⁺ بواسطة الخلية بدلا من النشاط الكهربائي.
      1. تحقق من جودة البيانات المكتسبة: عند 3 ملي مولار من الجلوكوز ، يجب أن يكون نشاط α الخلية مرئيا / قابلا للاكتشاف بوضوح. تأكد من أن هذا هو الحال وانتقل إلى التصوير بفاصل زمني على نطاق واسع.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات هدف 40x/1.3 GCaMP6f ، في ناقل الفيروسات الغدية (النوع البشري 5) ناقلات بيولابيس 1910 مصل الأبقار الجنينية سيجما ألدريتش F7524-500 مل RPMI متوسط ثيرمو فيشر (جيبكو ، لايف تكنولوجيز) 61870044 البنسلين / الستربتومايسين ثيرمو فيشر (جيبكو ، لايف تكنولوجيز) 15140122 مجهر Axiovert 200 فلو 4 ثيرمو فيشر (تقنيات الحياة) F14201