مقالة منهجية

عزل خلايا أسينار الأولية: طريقة لعزل خلايا أسينار من بنكرياس الفأر

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Fleming Martinez ، A. K. ، وآخرون. تقليد ومعالجة حؤول البنكرياس من أسينار إلى قنوي في زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو التقنية المستخدمة لعزل خلايا البنكرياس - الخلايا الخارجية - التي تحتوي على مجموعة متنوعة من الإنزيمات الهضمية. تعتبر خلايا الأسينار الأولية مفيدة في دراسة خارج الجسم الحي للحؤول من أسينار إلى قنوي (ADM) - وهو حدث مبكر في الإصابة بسرطان البنكرياس.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية في جوف.

< p class = "jove_title" >1. عزل خلايا Acinar

  1. التضحية بالفأر عن طريق تحريض ثاني أكسيد الكربون2 ، وقم بخلع عنق الرحم. تشريح البنكرياس على الفور. لتشريح البنكرياس ، قم أولا بتثبيت أقدام الفأر على غطاء البوليسترين ، وقم بتوجيه الفأر بحيث يكون الذيل مواجها للباحث ، ورش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول.
    ملاحظه: كان الفأر المستخدم في النتائج التمثيلية أنثى غير معدلة وراثيا تبلغ من العمر 12 أسبوعا ولديها خلفية C57BL / 6. تتم مناقشة اختيار الماوس بشكل أكبر في قسم المناقشة.
    1. باستخدام مجموعة من المقصات والملقط المعقم ، ارفع الفراء / الجلد بالملقط في خط الوسط واستخدم المقص لعمل شق عبر الفراء والجلد من فتحة مجرى البول إلى منطقة الحجاب الحاجز / القفص الصدري.
    2. قم بعمل شقوق إضافية إلى اليسار واليمين بحيث يتم قطع الفراء / الجلد لخلق رؤية واضحة لتجويف البطن. ثم قم بتقطيع البطانة البريتونية (أسفل المنتصف وإلى اليمين واليسار) واسحبها بعيدا عن الأعضاء ، كما حدث مع الفراء / الجلد.
    3. ارفع الأمعاء بالملقط وضعها على الجانب الأيسر من الفأر لخلق مساحة لرؤية البنكرياس ، وهو لونه وردي فاتح ، ومتصل بالطحال ، وهو بيضاوي أحمر داكن. يتميز نسيج البنكرياس بقوامه الإسفنجي الناعم. اقطع البنكرياس الذي يمتد على طول المعدة ويتشابك مع الأمعاء.
    4. افصل الطحال عن البنكرياس. بعد ذلك ، ضع البنكرياس في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من HBSS مع 1x البنسلين والستربتومايسين وإحضاره إلى غطاء التدفق الصفيحي.
      ملاحظه: يجب أن تتم الخطوات المتبقية من البروتوكول باستخدام تقنية معقمة في غطاء التدفق الرقائقي.
  2. صب البنكرياس و HBSS (مع البنسلين والستربتومايسين) في قارب وزن فارغ ، وباستخدام الملقط ، اغسل البنكرياس عن طريق تحريكه. بعد ذلك ، انقل البنكرياس بالملقط إلى قارب وزن ثان يحتوي على HBSS (مع البنسلين - الستربتومايسين). مرة أخرى ، اغسل البنكرياس عن طريق الدوران.
  3. انقل البنكرياس إلى قارب الوزن الثالث HBSS (مع البنسلين والستربتومايسين) وابدأ في تقطيع البنكرياس إلى قطع صغيرة بحجم 5 مم أو أقل. بعد ذلك ، صب قطع البنكرياس و HBSS في أنبوب فارغ سعة 50 مل.
    1. للقيام بذلك ، استخدم الملقط لتحريك قطع البنكرياس إلى السائل أثناء قلب قارب الوزن. صب بمجرد أن تتوقف جميع القطع عن توصيل قارب الوزن. التقط أي قطع متبقية بالملقط واغسل الملقط في أنبوب 50 مل يحتوي على البنكرياس في HBSS باستخدام البنسلين والستربتومايسين.
  4. جهاز طرد مركزي عند 931 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ثم قم بإزالة HBSS (وأي دهون عائمة) عن طريق ماصتها بماصة سعة 5 مل.
  5. أضف 5 مل من الكولاجيناز (اصنع 40 مل من HBSS + 5٪ FBS ، و 20 مل من HBSS + 30٪ FBS ، و 5 مل من 2 مجم / مل من الكولاجيناز في HBSS. عقم الكولاجيناز عن طريق الترشيح (0.22 ميكرومتر من المسام) واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بكل من حلول HBSS على الجليد) إلى البنكرياس. تأكد من غطاء محكم الغلق عن طريق لف الأنبوب سعة 50 مل بغشاء بارافين بلاستيكي ثم ضعه في حاضنة تهتز عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية < / > ملاحظه: قد يختلف وقت هضم الكولاجيناز ، كما هو مذكور في المناقشة. في نهاية الحضانة ، يجب ألا تبقى قطع كبيرة من الأنسجة.
  6. لإيقاف التفكك، ضع الأنبوب المحتوي على البنكرياس على الثلج وأضف 5 مل من HBSS البارد + 5٪ FBS. جهاز طرد مركزي عند 931 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ثم يقوم بسحب المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 5 مل.
  7. قم بإعادة التعليق في 10 مل من HBSS + 5٪ FBS وجهاز طرد مركزي عند 931 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإخراج المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 5 مل وكرر هذه الخطوة مع 10 مل أخرى من HBSS + 5٪ FBS.
  8. أعد التعليق في 5 مل من HBSS + 5٪ FBS ، وباستخدام P1000 ، انقل 1 مل في المرة الواحدة من خلال شبكة 500 ميكرومتر إلى أنبوب سعة 50 مل. أضف 5 مل إضافية من HBSS + 5٪ FBS من خلال الشبكة باستخدام P1000 لغسل أي خلايا بنكرياس متبقية من خلال الشبكة.
  9. ضع تعليق الخلية من شبكة 500 ميكرومتر عبر شبكة 105 ميكرومتر عن طريق سحب 1 مل في المرة الواحدة باستخدام P1000. بعد ذلك ، قم بوضع تعليق الخلية برفق في أنبوب يحتوي على HBSS + 30٪ FBS. سوف تتشكل طبقة من تعليق الخلية في الأعلى. عند الطرد المركزي ، ستغرق خلايا الأسينار لتشكيل حبيبات.
  10. جهاز طرد مركزي عند 233 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في وسائط Waymouth الكاملة 1x.
    1. إذا كنت تشرع مباشرة في تضمين الخلايا في مصفوفة الكولاجين أو الغشاء القاعدي ، فقم بإعادة تعليقه بحجم 7 مل لكل بنكرياس. في حالة المضي قدما في العدوى الفيروسية الغدية أو الفيروسية العدسية، يتم تعليقها في 4 مل لكل بنكرياس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 37 درجة مئوية حاضنة اهتزاز الترمو: العلمية SHKE4000-7 5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية حاضنة نوير NU-5500 أنابيب 50 مل صقر 352070 وسادة ماصة ، 20 × 24 بوصة فيشربراند 1420662 إبرة انزلاقية BD بدقة 21 جم × 1/2 فيشر ساينتيك 305167 استخدم كدبابيس للتشريح دورق ، 600 مل فيشربراند FB-101-600 الطرد المركزي بيكمان كولتر جهاز الطرد المركزي Allegra X-15R الكولاجيناز النوع الأول ، المطثية النسيجية سيغما C0130-1G اصنع محلولا 100 مجم / مل عن طريق إذابة المسحوق في ماء معقم من درجة البيولوجيا الجزيئية. عند إذابة كمية واحدة ، قم بتخفيفها إلى 10 مجم / مل ، وقم بتعقيمها وقم بتعقيمها ووضع 1 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية. ديكساميثازون سيغما د1756 قم بإنشاء محلول 4 مجم / مل عن طريق إذابة المسحوق في الميثانول ، وحصته وتخزينه عند -20 درجة مئوية. الإيثانول ، 200 دليل مختبرات ديكون 2701 مصل الأبقار الجنينية سيغما F0926-100 مل ملقط أدوات العلوم الدقيقة 11002-12 ملقط أدوات العلوم الدقيقة 91127-12 محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) ، خال من الكالسيوم ، خال من المغنيسيوم ، بدون فينول أحمر فيشر ساينتيك SH3048801 دلو ثلج مستطيل فيشر ساينتيك 07-210-103 أكياس عينات LAB GUARD (للفأر بعد التشريح) مقبض صغير SBL2X69S بارافيلم بيميس PM992 يشار إليه باسم "فيلم البارافين البلاستيكي" في المخطوطة برنامج تلفزيوني فيشر ساينتيك SH30028.02 البنسلين - ستربتومايسين ثيرموفيشر العلمي 15140122 أطراف ماصة، 10 ميكرولتر الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1110-3700 أطراف الماصة، 1000 ميكرولتر أوليمبوس بلاستيك 24-165 رل أطراف الماصات، 200 ميكرولتر الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1111-1700 Pipet-Aid دروموند PIPETMAN Classic P10 ، 1-10 ميكرولتر جيلسون F144802 PIPETMAN Classic P1000 ، 200-1000 ميكرولتر جيلسون F123602 PIPETMAN Classic P20 ، 2-20 ميكرولتر جيلسون F123600 PIPETMAN Classic P200 ، 20-200 ميكرولتر جيلسون F123601 ماصات، 10 مل صقر 357551 ماصات، 25 مل صقر 357525 ماصات، 5 مل صقر 357543 شبكة بولي بروبلين ، 105 ميكرومتر مختبرات الطيف 146436 شبكة البولي بروبيلين ، 500 ميكرومتر مختبرات الطيف 146418 مقص أدوات العلوم الدقيقة 14568-12 مقص أدوات العلوم الدقيقة 14568-13 بيكربونات الصوديوم (مسحوق أبيض ناعم) فيشر ساينتيك بي ت 328-500 هيدروكسيد الصوديوم فيشر ساينتيك S318-500 مثبط فول الصويا تريبسين جيبكو 17075029 ملعقه فيشربراند 21-401-10 مرشحات Steriflip 50 مل ، 0.22 ميكرون ميليبور SCGP00525 النوع الأول من الكولاجين ذيل الفئران كورنينج 354236 وايموث MB 752/1 متوسط (مسحوق) سيغما W1625-10X1L وزن قارب ، سداسي ، متوسط فيشربراند 02-202-101

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HBSS FBS Waymouths

مقالات ذات صلة