تحريض حؤول أسينار إلى قنوي: طريقة لدراسة تمايز خلية أسينار إلى خلايا الأقنية في ثقافة ثلاثية الأبعاد خارج الجسم الحي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Fleming Martinez، A. K. et al. <a href = "https://www.jove.com/v/59096/" target = "_blank" > تقليد ومعالجة حؤول البنكرياس من أسينار إلى قنوي في ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تقنية التفريق بين خلايا البنكرياس إلى خلايا الأقنية في ثقافة ثلاثية الأبعاد خارج الجسم الحي. يساعد هذا على فهم الآليات التي تنظم حؤول الأسينار إلى الأقنية (ADM) ، وهي عملية رئيسية في التطور المبكر لسرطان البنكرياس.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد والحلول وقواعد المصفوفة ثلاثية الأبعاد

1. قم بقص شبكات البولي بروبيلين 500 ميكرومتر و 105 ميكرومتر إلى مربعات 76 مم × 76 مم. اطو كل مربع إلى نصفين مرتين لإنشاء مربع مطوي أصغر. ضع مربعا شبكيا واحدا بحجم 500 ميكرومتر ومربعا شبكيا واحدا بحجم 105 ميكرومتر في كيس قابل للتعقيم.
2. مربعات شبكة البولي بروبلين الأوتوكلاف ، وكذلك زوجان من المقص والملقط.
3. اصنع 100 مل من محلول 10x Waymouth. قلب قارورة واحدة (14 جم) من مسحوق وايموث في 50 مل من الماء منزوع الأيونات (DI) ، وعند الذوبان ، أضف 30 مل من بيكربونات الصوديوم 7.5٪ (75 جم / لتر). ارفع الحجم النهائي إلى 100 مل باستخدام تعقيم الماء DI والفلتر.
   1. قم بتخزين 10x وسائط Waymouth عند 4 درجات مئوية واستخدمها لتحضير جل الكولاجين و 1x وسائط Waymouth. عندما تتشكل الرواسب ، تخلص منها.
4. اصنع 50 مل من وسائط Waymouth الكاملة 1x لكل بنكرياس عن طريق إضافة 125 ميكرولتر من 40 مجم / مل مثبط التربسين من فول الصويا ، و 12.5 ميكرولتر من 4 مجم / مل ديكساميثازون ، و 500 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنينية (FBS). تعقيم عن طريق الترشيح واستخدمه في غضون 48 ساعة.
5. قم بإعداد قواعد مصفوفة ثلاثية الأبعاد باستخدام مصفوفة الكولاجين أو الغشاء القاعدي (انظر جدول المواد للحصول على معلومات المنتج). عند سحب القاعدة ، ضع اللوحة على الجليد ، وتجنب الفقاعات ، وقم بتدوير اللوحة فور سحب حجم كل بئر لضمان التغطية الكاملة.
   1. قم بإنشاء قواعد الكولاجين عن طريق خلط المكونات التالية على الثلج في غطاء زراعة الأنسجة: 5.5 مل من كولاجين ذيل الفئران من النوع الأول ، و 550 ميكرولتر من 10x Waymouth's Media ، و 366.6 ميكرولتر من 0.34 M هيدروكسيد الصوديوم (مفلتر).
      ملاحظة: هذا حل كاف لصنع قواعد الكولاجين لطبق واحد مكون من 24 بئرا أو 12 بئرا أو 6 آبار. لوحة واحدة كافية لعزل أسينار من بنكرياس واحد.
   2. استخدم الأحجام التالية لطلاء قاعدة الكولاجين: 80 ميكرولتر (شريحة زجاجية ذات 8 آبار) ، 200 ميكرولتر (لوح 24 بئرا) ، 400 ميكرولتر (لوح 12 بئر) ، أو 800 ميكرولتر (صفيحة 6 آبار).
   3. بالنسبة لقواعد مصفوفة الغشاء القاعدي ، قم بسحب المصفوفة دون أي مكونات إضافية. استخدم الأحجام التالية لكل بئر: 50 ميكرولتر (شريحة زجاجية ذات 8 آبار) ، 120 ميكرولتر (صفيحة 24 بئرا) ، 240 ميكرولتر (لوح 12 بئر) ، أو 600 ميكرولتر (لوحة 6 آبار).
   4. دع القواعد تتصلب لمدة 30 دقيقة على الأقل في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) قبل إنشاء طبقة ثانية من المصفوفة مع خلايا مدمجة فوق هذه القواعد.
6. استعدادا لعزل الأسينار ، احتفظ بدورق واحد سعة 600 مل ، وثلاثة أنابيب سعة 50 مل ، ومقص معقم ، وزوج من الملقط المعقم ، ودلو ثلج تحت غطاء المحرك بثلاثة قوارب وزن. بعد ذلك ، اصنع 30 مل من HBSS مع 300 ميكرولتر من 100x البنسلين والستربتومايسين ، مع وضع 10 مل في كل من قاربي الوزن والاحتفاظ ب 10 مل الأخيرة في أنبوب سعة 50 مل (للاستخدام في الخطوتين 1.8.2 و 2.1.4).
7. اصنع 40 مل من HBSS + 5٪ FBS ، و 20 مل من HBSS + 30٪ FBS ، و 5 مل من 2 مجم / مل من الكولاجيناز في HBSS. عقم الكولاجيناز عن طريق الترشيح (0.22 ميكرومتر من المسام) واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة. احتفظ بكل من حلول HBSS على الجليد.
8. قم بتجميع مساحة عمل لتشريح البنكرياس ، والتي يمكن إجراؤها على مقعد المختبر.
   1. ضع وسادة ماصة على الطاولة ، جنبا إلى جنب مع غطاء من البوليسترين مغطى بورق الألمنيوم. ثم ضع منشفة ورقية بها 4 دبابيس فوق ورق القصدير.
   2. احتفظ بالعناصر التالية في متناول مساحة عمل التشريح: كيس حرق ، ومجموعة واحدة من المقصات والملقط المعقم ، وزجاجة رذاذ تحتوي على 70٪ من الإيثانول ، ودلو ثلج (مع أنبوب 50 مل من HBSS يحتوي على البنسلين - الستربتومايسين من الخطوة 1.6).
9. اضبط جهاز الطرد المركزي على 4 درجات مئوية وشاكر على 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >2. عزل خلايا Acinar

1. التضحية بالفأر عن طريق تحريض ثاني أكسيد الكربون₂ ، وقم بخلع عنق الرحم. تشريح البنكرياس على الفور. لتشريح البنكرياس ، قم أولا بتثبيت أقدام الفأر على غطاء البوليسترين ، وقم بتوجيه الفأر بحيث يكون الذيل مواجها للباحث ، ورش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول.
   ملاحظة: كان الفأر المستخدم في النتائج التمثيلية أنثى غير معدلة وراثيا تبلغ من العمر 12 أسبوعا وذات خلفية C57BL / 6. تتم مناقشة اختيار الماوس بشكل أكبر في قسم المناقشة.
   1. باستخدام مجموعة من المقصات والملقط المعقم ، ارفع الفراء / الجلد بالملقط في خط الوسط واستخدم المقص لعمل شق عبر الفراء والجلد من فتحة مجرى البول إلى منطقة الحجاب الحاجز / القفص الصدري.
   2. قم بعمل شقوق إضافية إلى اليسار واليمين بحيث يتم قطع الفراء / الجلد لخلق رؤية واضحة لتجويف البطن. ثم قم بتقطيع البطانة البريتونية (أسفل المنتصف وإلى اليمين واليسار) واسحبها بعيدا عن الأعضاء ، كما حدث مع الفراء / الجلد.
   3. ارفع الأمعاء بالملقط وضعها على الجانب الأيسر من الفأر لخلق مساحة لرؤية البنكرياس ، وهو لونه وردي فاتح ، ومتصل بالطحال ، وهو بيضاوي أحمر داكن. يتميز نسيج البنكرياس بقوامه الإسفنجي الناعم. اقطع البنكرياس الذي يمتد على طول المعدة ويتشابك مع الأمعاء.
   4. افصل الطحال عن البنكرياس. بعد ذلك ، ضع البنكرياس في أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من HBSS مع 1x البنسلين والستربتومايسين وإحضاره إلى غطاء التدفق الصفيحي.
      ملاحظه: يجب أن تتم الخطوات المتبقية من البروتوكول باستخدام تقنية معقمة في غطاء التدفق الرقائقي.
2. صب البنكرياس و HBSS (مع البنسلين والستربتومايسين) في قارب وزن فارغ ، وباستخدام الملقط ، اغسل البنكرياس عن طريق تحريكه. بعد ذلك ، انقل البنكرياس بالملقط إلى قارب وزن ثان يحتوي على HBSS (مع البنسلين - الستربتومايسين). مرة أخرى ، اغسل البنكرياس عن طريق الدوران.
3. انقل البنكرياس إلى قارب الوزن الثالث HBSS (مع البنسلين والستربتومايسين) وابدأ في تقطيع البنكرياس إلى قطع صغيرة بحجم 5 مم أو أقل. بعد ذلك ، صب قطع البنكرياس و HBSS في أنبوب فارغ سعة 50 مل.
   1. للقيام بذلك ، استخدم الملقط لتحريك قطع البنكرياس إلى السائل أثناء قلب قارب الوزن. صب بمجرد أن تتوقف جميع القطع عن توصيل قارب الوزن. التقط أي قطع متبقية بالملقط واغسل الملقط في أنبوب 50 مل يحتوي على البنكرياس في HBSS باستخدام البنسلين والستربتومايسين.
4. جهاز طرد مركزي عند 931 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ثم قم بإزالة HBSS (وأي دهون عائمة) عن طريق ماصتها بماصة سعة 5 مل.
5. أضف 5 مل من الكولاجيناز (المخفف في HBSS في الخطوة 1.7) إلى البنكرياس. تأكد من غطاء محكم الغلق عن طريق لف الأنبوب سعة 50 مل بغشاء بارافين بلاستيكي ثم ضعه في حاضنة تهتز عند 220 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية < / > ملاحظة: قد يختلف وقت هضم الكولاجيناز ، كما هو مذكور في المناقشة. في نهاية الحضانة ، يجب ألا تبقى قطع كبيرة من الأنسجة.
6. لإيقاف التفكك، ضع الأنبوب المحتوي على البنكرياس على الثلج وأضف 5 مل من HBSS البارد + 5٪ FBS. جهاز طرد مركزي عند 931 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية ثم يقوم بسحب المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 5 مل.
7. قم بإعادة التعليق في 10 مل من HBSS + 5٪ FBS وجهاز طرد مركزي عند 931 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإخراج المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 5 مل وكرر هذه الخطوة مع 10 مل أخرى من HBSS + 5٪ FBS.
8. أعد التعليق في 5 مل من HBSS + 5٪ FBS ، وباستخدام P1000 ، انقل 1 مل في المرة الواحدة من خلال شبكة 500 ميكرومتر إلى أنبوب سعة 50 مل. أضف 5 مل إضافية من HBSS + 5٪ FBS من خلال الشبكة باستخدام P1000 لغسل أي خلايا بنكرياس متبقية من خلال الشبكة.
9. ضع تعليق الخلية من شبكة 500 ميكرومتر عبر شبكة 105 ميكرومتر عن طريق سحب 1 مل في المرة الواحدة باستخدام P1000. بعد ذلك ، قم بوضع تعليق الخلية برفق في أنبوب يحتوي على HBSS + 30٪ FBS. سوف تتشكل طبقة من تعليق الخلية في الأعلى. عند الطرد المركزي ، ستغرق خلايا الأسينار لتشكيل حبيبات.
10. جهاز طرد مركزي عند 233 × جم لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في وسائط Waymouth الكاملة 1x.
    1. إذا كنت تشرع مباشرة في تضمين الخلايا في مصفوفة الكولاجين أو الغشاء القاعدي ، فقم بإعادة تعليقه بحجم 7 مل لكل بنكرياس. في حالة المضي قدما في العدوى الفيروسية الغدية أو الفيروسية العدسية، يتم تعليقها في 4 مل لكل بنكرياس.

< p class = "jove_title" >3. عدوى فيروسية

1. نظرا لأن بنكرياس واحد كاف لاثنين من العدوى الفيروسية (السيطرة والتجريبية ، على سبيل المثال ، null و cre) ، قم بتقسيم تعليق الخلية بين أغطية لوحين 35 مم. يسمح استخدام غطاء الألواح بالعدوى في التعليق وبالتالي سهولة الحركة على الركيزة النهائية لاحقا.
   1. عند العمل مع الفيروسات ، انقع جميع أطراف الماصة المستخدمة في مبيض بنسبة 10٪ لمدة 15 دقيقة على الأقل.
      ملاحظه: يعمل استخدام الألواح مقاس 35 مم وحجم 4 مل بشكل جيد مع خلايا الفئران غير المعدلة وراثيا التي يتراوح عمرها بين 8 و 16 أسبوعا. قد يلزم تعديل حجم اللوحة وحجمها للحيوانات ذات البنكرياس الأصغر أو الأكبر.
2. بالنسبة للعدوى الفيروسية الغدية ، أضف الفيروس (بعيار لا يقل عن 10⁷ TU / mL) عند تخفيف 1: 1,000 إلى غطاء كل لوحة ودوامة (الشكل 1 ، GFP denovirus). ضع الألواح في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) وقم بتحريكها كل 15 دقيقة لمدة 1 ساعة. استمر في الحضانة لمدة ساعتين إضافيتين ثم انتقل إلى تضمين الخلايا في مصفوفة الكولاجين أو الغشاء القاعدي.
3. بعد الانتهاء من العمل الفيروسي في الغطاء ، انقع جميع المكونات في الغطاء مع مبيض 10٪ لمدة 15 دقيقة على الأقل ثم نظف المبيض جيدا باستخدام 70٪ من الإيثانول.

< ص الفئة = "jove_title" >4. تضمين الخلايا في مصفوفة الكولاجين أو الغشاء القاعدي

1. اصنع جل الكولاجين على الثلج عن طريق الجمع بين 7 مل من كولاجين ذيل الفئران من النوع الأول (3.3 مجم / مل) ، و 700 ميكرولتر من وسائط 10x Waymouth ، و 466.6 ميكرولتر من 0.34 M هيدروكسيد الصوديوم.
2. مع أخذ كميات متساوية من هلام الكولاجين وتعليق الخلايا ، واخلطها برفق. في حالة إضافة محفز أو مثبط ، امزجه مع تعليق خلايا الكولاجين. لوحة واحدة بئر في كل مرة (لوحات من الخطوة 1.5.3) ؛ مع إبقاء اللوحة على الجليد ، قم بتحريكها لتوزيع طبقة خلية الكولاجين بالتساوي.
   1. في كل بئر ، قم بسحب الأحجام التالية من تعليق خلايا الكولاجين: 200 ميكرولتر (شريحة زجاجية ذات 8 آبار) ، 500 ميكرولتر (صفيحة 24 بئرا) ، 1000 ميكرولتر (لوح 12 بئر) ، أو 2000 ميكرولتر (صفيحة 6 آبار). لاحظ أن ADM يتم إحداثه عن طريق التحفيز باستخدام TGF-α (50 نانوغرام / مل) في الشكل 1.
3. لتضمين الخلايا في مصفوفة الغشاء القاعدي ، امزج مصفوفة الغشاء القاعدي المكونة من جزء واحد مع تعليق الخلية المكون من جزأين. كما هو الحال مع الكولاجين ، احتفظ بتعليق خلية المصفوفة وكذلك اللوحة على الجليد. Pipet بئر واحد في كل مرة باستخدام نفس الأحجام المذكورة في 4.2.1 ودوامة للتوزيع المتساوي.
4. ضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 30 دقيقة لتصلب ثم أضف 1x وسائط Waymouth الكاملة مع أي محفز أو مثبط (يستخدم الشكل 1 TGF-α عند 50 نانوغرام / مل). قم بتغيير الوسائط (بمحفز أو مثبط) في اليوم التالي ثم كل يومين. اعتمادا على الحافز ، يمكن ملاحظة ADM بين اليوم 3 واليوم 5.

النتائج

الشكل 1: النتائج التمثيلية لخلايا الأسينار الأولية المطلية داخل الكولاجين بعد التحفيز باستخدام TGF-α.أصيبت خلايا أسينار الأولية من فأر غير معدل وراثيا بفيروس GFP-adenovirus ، المضمن في الكولاجين الأول أو مصفوفة الغشاء القاعدي ، وتم تحفيزها مع أو بدون TGF-α (50 نانوغرام / مل). بعد أربع وعشرين ساعة من الإصابة بالفيروس الغدي GFP ، تم التقاط الصور لإظهار كفاءة العدوى. بعد خمسة أيام من ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية حاضنة نوير NU-5500 أنابيب 50 مل صقر 352070 دورق ، 600 مل فيشربراند FB-101-600 الفيروس الغدي ، Ad-GFP ناقلات بيولابيس 1060 ديكساميثازون سيغما د1756 قم بإنشاء محلول 4 مجم / مل عن طريق إذابة المسحوق في الميثانول ، وتخزينه في -20 درجة مئوية مصل الأبقار الجنينية سيغما F0926-100 مل ملقط أدوات العلوم الدقيقة 11002-12 شريحة زجاجية ، 8 آبار لاب تيك 177402 دلو ثلج مستطيل فيشر ساينتيك 07-210-103 ماتريجيل كورنينج 356234 يشار إليها باسم "مصفوفة الغشاء القاعدي" في المخطوطة. برنامج تلفزيوني فيشر ساينتيك SH30028.02 البنسلين - ستربتومايسين ثيرموفيشر العلمي 15140122 طبق ، 12 بئر كورنينج كوستار 3513 لوحة ، لوحة 24 بئر كورنينج كوستار 3524 طبق 6 آبار صقر 353046 شبكة بولي بروبلين ، 105 ميكرومتر مختبرات الطيف 146436 شبكة البولي بروبيلين ، 500 ميكرومتر مختبرات الطيف 146418 مقص أدوات العلوم الدقيقة 14568-12 بيكربونات الصوديوم (مسحوق أبيض ناعم) فيشر ساينتيك بي ت 328-500 هيدروكسيد الصوديوم فيشر ساينتيك S318-500 مثبط فول الصويا تريبسين جيبكو 17075029 النوع الأول من الكولاجين ذيل الفئران كورنينج 354236 PIPETMAN Classic P10 ، 1-10 ميكرولتر جيلسون F144802 ماصات، 5 مل صقر 357543 أطراف ماصة، 10 ميكرولتر الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1110-3700 أطراف الماصة، 1000 ميكرولتر أوليمبوس بلاستيك 24-165 رل أطراف الماصات، 200 ميكرولتر الولايات المتحدة الأمريكية العلمية 1111-1700 ماصات، 25 مل صقر 357525 Pipet-Aid دروموند ماصات، 10 مل صقر 357551 PIPETMAN Classic P200 ، 20-200 ميكرولتر جيلسون F123601 PIPETMAN Classic P1000 ، 200-1000 ميكرولتر جيلسون F123602 PIPETMAN Classic P20 ، 2-20 ميكرولتر جيلسون F123600 وايموث MB 752/1 متوسط (مسحوق) سيغما W1625-10X1L وزن قارب ، سداسي ، متوسط فيشربراند 02-202-101