عزل جزر البنكرياس من خلال نضح الكولاجيناز: طريقة إنزيمية لعزل خلايا جزر البنكرياس

الملخص

المصدر: Villarreal D. et al. بروتوكول بسيط عالي الكفاءة لعزل جزر البنكرياس عن الفئران. J. Vis. Exp. (2019)

جزر البنكرياس ، وتسمى أيضا جزر لانجرهانز ، هي مجموعة من خلايا الغدد الصماء التي تنتج هرمونات لتنظيم الجلوكوز والوظائف البيولوجية المهمة الأخرى. يشرح هذا البروتوكول طريقة لعزل جزر البنكرياس عن طريق نشر الكولاجيناز أولا عبر أمبولا فاتر لهضم أنسجة البنكرياس الخارجية والطرد المركزي المتدرج المبسط لتنقية الجزر من الفئران.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

الأدوات الجراحية المطلوبة موضحة في الشكل 1 ويظهر الرسم التخطيطي للإجراء في الشكل 2.

1. الحلول

1. قم بإعداد محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS) عن طريق إضافة 100 مل من 10X HBSS (من المخزون) إلى 900 مل من الماء المقطر لصنع 1 لتر HBSS (1X).
2. قم بإعداد محلول STOP (يجب أن يكون طازجا ويجب استخدامه في غضون 1 ساعة) عن طريق إضافة 50 مل من مصل الأبقار الجنينية 100X (FBS) إلى 450 مل من 1X HBSS المثلج ؛ وهذا يجعل محلول STOP 500 مل. احتفظ بمحلول STOP عند 4 درجات مئوية.
3. تحضير محلول الكولاجيناز P (يجب أن يكون طازجا في غضون ساعة واحدة من استخدامه) عن طريق إضافة 1 مجم / مل من الكولاجيناز P إلى المثلج البارد 1X HBSS ؛ استخدم 6 مل / فأر.
   1. أضف 0.05٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل البقر (BSA) إلى محلول الكولاجيناز P (وهذا يوفر العناصر الغذائية للجزر المعزولة). على سبيل المثال ، استخدم 3 مجم BSA في محلول 6 مل من الكولاجيناز P. استمر في وضع الثلج.
   2. احسب وقم بإعداد كمية الكولاجيناز P اللازمة لجميع الفئران في أنبوب واحد سعة 50 مل.
4. تحضير وسط RPMI 1640 الكامل بإضافة 10٪ FBS و100 وحدة / مل من البنسلين و100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ومكملات خلية INS-1 (10 ملي مولار HEPES ، و2 ملي مولار لجلوتامين ، و1 ملي مولار بيروفات الصوديوم ، و0.05 ملي مولار 2-ميركابتو إيثانول) إلى 500 مل من وسائط RPMI 1640 تحتوي على 5.5 ملي مولار من الجلوكوز لاستخدامها في الاستزراع والحضانة طوال الليل.

< p class = "jove_title" >2. التحضير

1. املأ ثلاثة أنابيب سعة 50 مل من محلول مثبط RNase سعة 25 مل أو 70٪ إيثانول أو H₂O المقطر. سيتم استخدام هذه المحاليل لتنظيف الأدوات الجراحية قبل وأثناء العملية.
2. انقع أطراف الأدوات في محلول تثبيط RNase لمدة 30 دقيقة قبل بدء البروتوكول ؛ هذا يلغي أي RNase محتمل على الأدوات.
3. وسادات ماصة مقطوعة مسبقا إلى حجم 6 بوصات × 6 لاستخدامها أثناء الجراحة.
4. قم بإعداد محلول 1X HBSS مسبقا وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية. قم بإعداد محلول STOP قبل الجراحة. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
5. تحضير محلول الكولاجيناز P مباشرة قبل الجراحة وتخزينه على الثلج.
   ملاحظه: يجب استخدام هذا في غضون ساعتين من التحضير.
6. قم بتسمية 50 مل من الأنابيب للهضم والتنقية ؛ قم بإعداد أنبوبين لكل فأر ، أحدهما للهضم والآخر لتنقية الجزر. تأكد من وجود معرف على كلا الأنبوبين.
7. أضف 3 مل من محلول الكولاجيناز P في أول أنبوب سعة 50 مل. سيتم حقن 3 مل المتبقية من الكولاجيناز P.
8. اسحب 3 مل المتبقية من محلول الكولاجيناز في حقنة سعة 3 مل مثبتة بإبرة 30 جم 1/2. ضع المحقنة على الثلج.

< p class = "jove_title" >3. الإجراء

1. قم بإزالة جميع الأدوات من محلول تثبيط RNase ، ثم اغمسها أولا في الأنبوب بنسبة 70٪ من الإيثانول ، ثم في الأنبوب الذي يحتوي على H₂O المقطر ، ثم جففها بالهواء على منشفة ورقية نظيفة.
2. ضع الفأر في حجرة تحتوي على 0.5 مل من الأيزوفلوران حتى يتم تخدير الفأر بعمق.
3. أخرج الماوس من الغرفة وتحقق من حالة التخدير عن طريق الضغط على وسادة القدم بالملقط. يعتمد التخدير العميق على ملاحظة أن التنفس يصبح بطيئا بشكل مطرد وأن الفأر غير متفاعل مع قرص القدم. بعد التأكد من أن الفأر مخدر بعمق ، قم بالقتل الرحيم للفأر مع خلع عنق الرحم ، ثم ضع الماوس على الوسادة الماصة.
   1. ضع الفأر المخدر على بطنه ، واضغط على الرقبة وخلع العمود الفقري من الدماغ عن طريق سحب الذيل.
4. قم بلصق أطراف الفأر في وضع ضعيف على الوسادة الماصة ، ورش الجسم بنسبة 70٪ من الإيثانول ، وامسح الفائض من الإيثانول الزائد.
5. استخدم ملقط زجاجي للغطاء ومقص جراحي منحني لعمل شقوق. قم أولا بعمل شق أفقي على جلد منطقة البطن (~ 3 سم) ، واسحب الجلد مفتوحا على مصراعيه لكشف جدار البطن. ثم قم بعمل شق عمودي (~ 3-4 سم) على الصفاق البطني لكشف البنكرياس بالكامل في تجويف البطن (الشكل 3).
6. ادفع فصوص الكبد بشكل متفوق لفضح القناة الصفراوية ، وستظهر على شكل أنبوب وردي باهت (الشكل 3).
7. حرك الأمعاء بعناية من المنطقة القطنية / الحرقفية اليمنى من تجويف البطن إلى اليمين ، مع تعريض القناة الصفراوية والشريان الكبدي (الشكل 3).
قم
8. بتثبيت القناة الصفراوية المشتركة بعناية باستخدام Schwartz micro serrefines (الشكل 1) بالقرب من الكبد قدر الإمكان.
9. حدد أمبولة فاتر ، التي تقع في حليمة الاثني عشر ، التي تشكلت من اتحاد قناة البنكرياس والقناة الصفراوية المشتركة. تبدو أمبولة فاتر منتفخة عند عرضها تحت مجهر التشريح وهي نقطة الدخول إلى القناة الصفراوية المشتركة (الشكل 4).
   ملاحظه: يمكن أن يؤدي ضبط شدة / زاوية ضوء مجهر التشريح إلى تسهيل تحديد موقعه.
10. أدخل المحقنة التي تحتوي على 3 مل من محلول الكولاجيناز P في أمبولة فاتر. ادفع الإبرة في القناة لحوالي 1/4 من طول القناة الصفراوية المشتركة (يؤدي الأمبولة إلى القناة) كما هو موضح في الشكل 5.
11. بمجرد أن تكون الإبرة في الأمبولة ، تأكد من أن اتجاه الإبرة يكون موازيا للقناة.
12. قم بتثبيت الإبرة عن طريق التثبيت باستخدام ملقط Adson الصغير لمنعها من ثقب القناة (الشكل 5).
قم
13. بحقن 3 مل من محلول الكولاجيناز P ببطء وثبات من المحقنة في القناة الصفراوية المشتركة (بما يكفي للشعور بالمقاومة) كما هو موضح في الشكل 6. الهدف هو إنشاء ضغط تدفق عكسي لإجبار الكولاجيناز على دخول قناة البنكرياس. يعتبر الحقن ناجحا إذا تم نفخ منطقة الرأس والرقبة والجسم والذيل في البنكرياس بالكامل.
    ملاحظه: سيكون محصول الجزيرة منخفضا إذا لم يتم نفخ البنكرياس بالكامل ، أو لم يتم تضخيم منطقة الطحال بالكامل. تحتوي منطقة الطحال على أكبر عدد من الجزر^{الصغيرة 6}. يمكن تأكيد التضخم من خلال ظهور مساحات مفتوحة بين أنسجة البنكرياس المملوءة بالمحلول.
14. قم بتشريح البنكرياس المنتفخ بعناية وضعه في أنبوب هضم سعة 50 مل يحتوي على 3 مل من محلول الكولاجيناز P المثلج.
    1. قم بإزالة البنكرياس باستخدام ملقط 2 (منحني ومايكرو أدسون ؛ انظر الشكل 1): (بدءا من الطحال ، اسحب البنكرياس بعيدا عن الطحال واستمر في الإزالة من المعدة وعلى طول الاثني عشر.
       ملاحظه: لا توجد شقوق مطلوبة.
    2. يقطع البنكرياس لمدة 3-5 ثوان في أنبوب الهضم باستخدام 3 مل من محلول الكولاجيناز P المثلج باستخدام مقص جراحي ناعم (الشكل 7 أ).
15. قم بتثبيت الأنبوب على رف في حمام مائي 37 درجة مئوية ورجه عند 100-120 دورة في الدقيقة لمدة 12-13 دقيقة تقريبا.
16. بعد الحضانة ، قم بهز الأنابيب برفق باليد لتعطيل الأنسجة حتى يصبح محلول هضم الكولاجيناز P متجانسا (الشكل 7 ب). يتم تأكيد التجانس من خلال ظهور يشبه الرمل للجزيئات الدقيقة من البنكرياس. عادة ما يكون حوالي 30 ثانية من المصافحة اللطيفة كافية. امسك الأنبوب للضوء لفحص ما إذا كان النسيج متجانسا بشكل جيد ؛ رج العبوة لمدة ~ 15 ثانية أخرى إذا لزم الأمر.
17. بمجرد هضمها ، ضع الأنابيب على الفور على الثلج وأضف 40 مل من محلول STOP المثلج البارد لإنهاء الهضم الأنزيمي.
    ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن ترك أنابيب الهضم على الجليد لمدة تصل إلى ساعتين ، إذا كانت تعمل على عدة فئران.
18. جهاز الطرد المركزي للأنبوب في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند 300 × جم لمدة 30 ثانية (درجة حرارة جهاز الطرد المركزي مرنة).
    ملاحظه: استخدم جهاز طرد مركزي دلو متأرجح بحيث يتم تشكيل حبيبات الأنسجة في الجزء السفلي من أنبوب 50 مل وليس على جدار الأنبوب. هذا أمر بالغ الأهمية لتحسين إنتاجية الجزر.
19. صب وكرر الطرد المركزي مع محلول STOP 2 مرات أخرى ، صب المحلول بعد كل دورة. استخدم 20 مل من محلول STOP لكل غسلة لاحقة.
    1. قبل كل دورة, قم بتعطيل الحبيبات عن طريق هز حبيبات الأنسجة برفق في أنبوب 50 مل في 20 مل محلول STOP.
20. أعد تعليق حبيبات الأنسجة مع 40 مل من HBSS المثلج البارد وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 30 ثانية.
21. صب وكرر الطرد المركزي باستخدام جهاز طرد مركزي متأرجح مع محلول HBSS مرتين أخريين ، وصب المحلول بعد كل دورة. استخدم 20 مل من HBSS لكل غسلة.
    1. قبل كل دورة ، قم بتعطيل الحبيبات لفصلها عن قاع الأنبوب عن طريق هز الأنبوب الذي يحتوي على 20 مل من محلول HBSS.
22. بعد آخر طرد مركزي إزالة جميع HBSS.
23. ثم أضف 5 مل من تدرج كثافة درجة حرارة الغرفة إلى 50 مل الأنبوب الذي يحتوي على الحبيبات. دوامة لفترة وجيزة بسرعة منخفضة حتى تتجانس.
24. أضف 5 مل أخرى من تدرج كثافة درجة حرارة الغرفة إلى أنبوب 50 مل. لا تقم بالدوامة / الخلط.< / > ملاحظه: من الأهمية بمكان أن تظل ثابتا وثابتا للسماح بتكوين تدرج أفضل دون انقطاع.
25. ماصة 10 مل من المخزن المؤقت HBSS بدرجة حرارة الغرفة في الأنبوب (الذي يحتوي على تدرج الكثافة) ، قطرة قطرة بلطف وببطء للسماح بتدرج التدرج. استخدم مسدس ماصة مع ماصة سعة 10 مل لإضافة HBSS بالتنقيط.
26. باستخدام جهاز طرد مركزي ذو دلو متأرجح ، قم بتدوير الأنابيب عند 1700 × جم لمدة 15 دقيقة. تأكد من تغيير سرعة كل من التسارع / التباطؤ إلى أدنى إعداد للحفاظ على التدرج (الشكل 7C).
27. بعد الدوران ، قم بإزالة الأنابيب بعناية دون إزعاج التدرج. باستخدام مسدس ماصة مبلل مسبقا ب HBSS البارد (الماصة HBSS لأعلى ولأسفل) ، قم بإخراج طبقة الجزر (5-10 مل) المتكونة بين تدرج الكثافة و HBSS في أنبوب تجميع الجزر الجديد سعة 50 مل.
    ملاحظه: من المفيد ترطيب الماصة باستخدام HBSS البارد قبل سحب الجزر لمنع الجزر من الالتصاق بالجدران الداخلية للماصة.
    1. في حالة عدم اكتمال الفصل ، ستكون الجزر مرئية في طبقة تدرج الكثافة ، وتخرج الماصة الكاملة 10 مل من تدرج الكثافة (الطبقة السفلية) جنبا إلى جنب مع طبقة الجزيرة المتكونة في الواجهة (فقط لترك حوالي 8-10 مل من الطبقة العليا HBSS خلفها).
       ملاحظه: يمكن أن يؤدي جمع كل من طبقة الجزيرة وطبقة تدرج الكثافة (الطبقة السفلية) إلى تجمع الحطام الذي قد يطيل وقت التقاط الجزيرة ، ولكن لن يتم تغيير أي خطوات أخرى. جمع كلتا الطبقتين ليس ضروريا عندما تتشكل طبقة الجزيرة بشكل جيد.
28. أضف 20 مل من HBSS المثلج إلى الأنبوب الجديد سعة 50 مل الذي يحتوي على جزر صغيرة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 350 × جم لمدة 3 دقائق في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح.
29. بعد الدوران ، قم بإخراج الماصة بعناية (لا تصب ) المادة الطافية (اترك ~ 3 مل في الأسفل) دون إزعاج الحبيبات التي تحتوي على الجزر الصغيرة في الأسفل. تخلص من المادة الطافية.
30. كرر الغسيل والطرد المركزي 3 مرات على الأقل. أضف 20 مل من HBSS في كل مرة ، وتأكد من تعليق الحبيبات قبل كل دورة.
31. قم بتسخين زجاجة الوسائط الكاملة RPMI-1640 في حمام مائي عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. بعد الطرد المركزي الأخير ، قم بإزالة كل HBSS وأضف 4 مل من وسائط RPMI-1640 الكاملة المعدة مسبقا (تحتوي على FBS و INS-1 مكمل الخلية والبنسلين / الستربتومايسين) إلى الحبيبات.
32. قم بإزاحة الحبيبات عن طريق تدوير الأنبوب برفق وصب وسائط RPMI-1640 على الفور في طبق بتري مقاس 100 مم. أضف 5 مل أخرى من وسائط RPMI-1640 إلى الأنبوب وقم بتدويرها برفق لغسل أي جزر صغيرة متبقية ، ثم اسكب الوسائط أيضا في نفس طبق بتري.
    1. تحت مجهر التشريح ، اختر الجزر الصغيرة السليمة من طبق بتري باستخدام ماصة سعة 20 ميكرولتر ، وضعها في طبق بتري جديد يحتوي على 10 مل من وسائط RPMI 1640 الكاملة. عند النظر إليها تحت مجهر التشريح ، يجب أن تظهر الجزر الكروية / المستطيلة واللون البني الذهبي مع سطح أملس مقارنة بالأنسجة الخارجية الشفافة نسبيا><. ملاحظه: عادة ما يتم ضبط تكبير مجهر التسلخ على 12.5-16x. يختلف محصول الجزيرة اعتمادا على عوامل مختلفة بما في ذلك سلالة الفأر وعمره وجنسه. ينتج عن هذا البروتوكول عادة 250-350 جزيرة صحية من فأر C57BL / 6J السليم الذي تتراوح أعمارهم بين 4 و 10 أشهر.
33. احتضان الجزر في حاضنة معقمة عند 37 درجة مئوية مع ضخ 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ و 95٪ هواء مرطب طوال الليل لإجراء التجارب في اليوم التالي ، أو قم بتجميد الجزر للتحليل المطلوب في وقت لاحق.
    1. بمجرد تجميد الجزر ، لا يمكن استخدامها لمقايسات الإفراز ، فقط الحمض النووي الريبي أو القياس الكمي. لجمع الخلايا للتجميد ، ضعها في مخزن مؤقت HBSS ، واجمع جميع الجزر في 200-500 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، وانقلها إلى أنبوب 1.5 مل ، وجهاز طرد مركزي 350 × جم لمدة 1-2 دقيقة ، وقم بإزالة المادة الطافية التي لا تترك أكثر من 30-40 ميكرولتر من المحلول ، ضعها في -20 درجة مئوية للتخزين قصير المدى (عدة أيام) أو -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: الأدوات الجراحية.< / > يتم عرض المقص الجراحي المنحني ، ملقط زجاجي الغطاء ، ملقط Adson الصغير ، ملقط منحني ، مقص جراحي صغير ، و Schwartz micro serrefines (مشبك الأوعية الدموية الدقيقة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات حقنة 3 مل دينار بحريني 309657 عقد الكولاجيناز P ملقط الغطاء الزجاجي VWR 82027-396 إمساك جلد الفأر للمساعدة في إجراء الشق ملقط منحني سيجما ألدريتش Z168696 إمساك الأنسجة أثناء إزالة البنكرياس أطباق بتري 100 مم VWR 30-2041 تستخدم لثقافة الجزر 30 جم 1/2 بوصة إبرة دينار بحريني 305106 لاختراق Ampulla of vater لتوصيل Collagenase P - يتم استخدام هذا المقياس لأنه يناسب بشكل جيد معظم اتفاقية التنوع البيولوجي أنبوب 50 مل VWR 89039-658 عقد أنسجة البنكرياس المهضومة والكولاجيناز P والجزر المنقاة وسادات ماصة مع مقاومة للماء
حاجز الرطوبة VWR 82020-845 لامتصاص الدم من العمليات الجراحية جهاز طرد مركزي 5810R مع تأرجح
الجرافة والقدرة على التباطؤ إيبندورف هاتف: 5811FJ478114 تستخدم لأنسجة تكوير الأنسجة ، يتم تشكيل الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي - هناك حاجة إلى جهاز طرد مركزي دلو متأرجح. كما أن ميزة الإعلان مهمة لتشكيل طبقات التدرج كولاجيناز P- 1 جم تشخيص روش 11249002001 لهضم البنكرياس الإفرازي مقص جراحي منحني فيشر ساینتيف 13-804-21 لقطع بطن الفأر المفتوح مجهر تشريح أوليمبوس SZX16 تستخدم لتحديد الهياكل التشريحية الرئيسية بدقة
توصيل الكولاجيناز إلى البنكرياس محلول الملح المتوازن من هانك 10x كورنينج 20-023-السيرة الذاتية خلايا الغسيل هيستوباك -1077 سيغما RNBF5100 لتشكيل التدرج مصدر الضوء ليدز LR92240 تعزيز رؤية المجهر RPMI-1640 الوسائط بدون L-Glutamine كورنينج 15-040-السيرة الذاتية زراعة الجزر شوارتز ميكرو سيريفين (مشبك الأوعية الدموية الدقيقة) أدوات العلوم الدقيقة 18052-01 لقط القناة الصفراوية المشتركة و
الشريان الكبدي حمام مائي يهتز بويكل / جرانت 8R0534008 مهم للهضم الميكانيكي للأنسجة الخارجية مقص جراحي صغير VWR 82027-578 قطع الأنسجة الملتصقة بالبنكرياس RNaseZap فيشر ساینتيف AM9780 لإزالة RNase إيزوفلوران بيرامال B13B16A لتخدير الفئران قبل الجراحة