تلطيخ الفلورسنت المناعي للكرويات: تقنية لتحليل الكرويات للتعبير عن التعبير عن المستضد داخل الخلية وخارجها

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: كافاكو ، إيه سي إم وآخرون. نموذج كروي ثلاثي الأبعاد كنظام فسيولوجي أكثر لتمايز الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تقنية تلطيخ الفلورسنت المناعي للكرات لفهم تمايز الخلايا الليفية أو CAFs. يساعد هذا البروتوكول في الكشف عن التعبير عن المستضدات داخل الخلية وخارجها ، بما في ذلك ترسب بروتينات ECM داخل الكرويات.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تلطيخ الفلورسنت المناعي للفيرويدات

1. اجمع الكرات الكروية بعد حوالي 24 ساعة في أنبوب تفاعل واحد سعة 1.5 مل لكل حالة تجريبية أو لكل بروتين ليتم تحليله. على سبيل المثال ، ضع كرويات iNFs المحفزة باستخدام TGF-β1 في أنبوب مختلف عن iNFs الضابطة ، والتي لم تتم معالجتها. لتجنب تمزق الكرويات بسبب قوى القص القوية جدا ، قم بقص نهاية طرف الماصة لتكبير الفتحة. قم بتضمين ما لا يقل عن 5-10 كرويات في أنبوب تفاعل واحد ، للسماح بالتكرار ومراعاة الخسائر المحتملة أثناء خطوات الغسيل.
2. الطرد المركزي الكروية باستخدام جهاز طرد مركزي أعلى مقاعد البدلاء لحوالي 30-60 ثانية عند 1,000 × جم. قم بإزالة المادة الطافية المحتوية على ميثيل السليلوز بعناية عن طريق سحب العينات، دون إزعاج الكرويات المحببة.
3. يغسل ب 50 ميكرولتر من 1x PBS. كرر خطوة الطرد المركزي وقم بإزالة PBS بعناية عن طريق سحب العينات، كما هو موضح في 1.2.
4. اعتمادا على البروتين المراد تلطيخه ، قم بالتثبيت باستخدام 50 ميكرولتر من 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (ل αSMA و NG2 و integrin α3β1) أو مع 50 ميكرولتر من الميثانول لمدة 10 دقائق عند -20 درجة مئوية (للوحدات الفرعية Laminein-332).
5. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.3.
6. قم باختراق الخلايا بنسبة 0.1٪ Triton-X في PBS لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
7. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.3 ثلاث مرات.
8. احتضان الفيريات في PBS التي تحتوي على 5٪ FBS و 2٪ BSA ، لمدة ساعة واحدة في RT لمنع مواقع تفاعل البروتين غير المحددة.
9. احتضان الأجسام الكروية ب 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية في PBS و 2.5٪ FBS و 1٪ BSA عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: مضاد αSMA Cy-3 مترافق ومضاد ل NG2 عند 5 ميكروغرام / مل. BM2 مضاد لللامينين α3 ، 6F12 مضاد لللامينين β3 ومضاد لللامينين γ2 20 ميكروغرام / مل.
10. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.3 ثلاث مرات.
11. احتضان الأجسام الكروية ب 30 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية في PBS و 2.5٪ FBS و 1٪ BSA في RT لمدة 90 دقيقة. الأجسام المضادة الثانوية التالية المستخدمة هي: Alexa 488 مضاد للأرانب ومضاد للفأر (5 ميكروغرام / مل).
12. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.3 ثلاث مرات.
13. احتضان الخلايا ب 30 ميكرولتر من محلول تلطيخ DAPI لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
14. كرر خطوة الغسيل كما هو موضح في الخطوات 1.2-1.3.
15. ضع الكرات الكروية على شريحة زجاجية ، في قطرة من PBS ، باستخدام ماصة باستور زجاجية.
16. قم بتصوير الكرويات عن طريق المجهر الفلوري في مجهر المسح الضوئي بالليزر باستخدام تكبير 10x. خذ مقطعا عرضيا بصريا مختلفا للكروي في مستويات بصرية مختلفة من مكدس z (15-20 مستوى مكدس). لتحديد إعدادات الليزر في المجهر ، استخدم كرويا يتكون من خلايا سالبة للمستضد محل الاهتمام أو كروي ملطخ فقط بالجسم المضاد الثانوي. أعد استخدام نفس الإعدادات لجميع العينات التي ستتم مقارنتها.
17. قم بتحليل الصور المجهرية باستخدام برنامج ImageJ كما تم نشره سابقا. يتم تلخيص الخطوات في الشكل 1. كخلفية، حدد كثافة الإشارة المتكاملة لمنطقة الاهتمام الخالية من الخلايا (ROI). احسب إجمالي مضان الخلية المصححة (TCCF) على النحو التالي:
    TCCF = كثافة الإشارة المتكاملة - (مساحة الكروية المختارة × متوسط مضان الخلفية)
18. حدد إجمالي التألق المصحح (TCF) للكرات حيث تم تطبيع TCCF إلى منطقة الكروية وعدد المداخن.
    TCF = TCCF من الكرة الكروية / (مساحة الكرويات × عدد المداخن)

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. خطوات متسلسلة للقياس الكمي للتلطيخ المناعي الفلوري لبروتين ذي أهمية في الكرويات ، باستخدام ImageJ. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المواد