تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >1.
التحضير لزراعة الورم
- إسكان
- احصل على فئران C57BL / 6 عامة من بائع تربية تجاري.
- الفئران المنزلية (5) في أقفاص فردية جيدة التهوية في الظروف التالية: درجة الحرارة: 20-26 درجة مئوية ؛ الرطوبة 30-70٪ ؛ دورة الإضاءة: 12 ساعة فاتحة و 12 ساعة مظلمة.
- استخدم فراش كوز الذرة الذي يتم تغييره أسبوعيا.
- بالنسبة للنظام الغذائي ، قم بتوفير طعام حبيبي جاف معقم بالإشعاع خلال فترة الدراسة بأكملها.
- بالنسبة للمياه ، وفر للحيوانات حرية الوصول إلى مياه الشرب المعقمة.
- تحضير شظية الورم من المتبرع
- ابدأ بمراقبة وزن الجسم (BW) ، عن طريق الوزن باستخدام الميزان ، وحجم الورم (TV) ، عن طريق قياس الفرجار ، للفئران المانحة الحاملة للورم.
- عندما يصل التلفزيون إلى 500-1,200 مم3 ، قم بالقتل الرحيم للحيوان في غطاء بيولوجي وفقا للبروتوكول.
- تعقيم الجلد حول الورم باستخدام مسحات اليودوفور.
- إزالة الورم جراحيا حسب البروتوكول.
- افحص بصريا وعن طريق الجس بحثا عن وجود أورام ملموسة قبل الإنهاء.
- للإنهاء ، قم أولا بالقتل الرحيم للفئران وفقا للبروتوكول المعتمد ، وافتح البطن وافحص البنكرياس بصريا بحثا عن الأورام.
- اقطع الورم عن طريق جراحة ما بعد الوفاة وأضفه إلى PBS البارد. ضع جميع في غرفة قتل رحيم نظيفة وغير مشحونة وشفافة بغطاء خاص مع منفذ لتوصيل ثاني أكسيد الكربون المراد استخدامه.
- قم بتصريف الغاز في الغرفة بمعدل تدفق ينتج عنه فقدان وعي سريع مع الحد الأدنى من الضيق للحيوان. يجب أن يكون معدل التدفق الأمثل لثاني أكسيد الكربون2 حوالي 2-2.5 لتر / دقيقة.
- راقب بصريا كل أثناء إجراء القتل الرحيم للتأكد من حصول جميع على تركيزات كافية من الغازات وعدم استعادة وعيها أثناء إجراء القتل الرحيم.
- حافظ على تدفق الغاز لمدة دقيقة واحدة على الأقل بعد الموت السريري الواضح لتقليل احتمالية تعافي (إذا كان انقطاع النفس ولكن ليس ميتا).
- إزالة الأنسجة المجاورة غير الورمية. يمكن تصوير الورم الذي تم تنظيفه بسرعة.
ضع أنسجة الورم في RPMI-1640 واستمر في وضع الثلج قبل التفكك.
ملاحظه: يتم تعبئة جثث وتخزينها في الفريزر المناسب في انتظار إزالتها.
- ضع الورم في طبق بتري يحتوي على 20 مل من PBS (قم بتبريد الوسائط مسبقا أو المخزن المؤقت إلى 4 درجات مئوية قبل القتل الرحيم للحيوانات).
- إذا كان هناك دم ملوث ، فقم بنقل الورم إلى طبق بتري آخر وغسل الورم باستخدام PBS.
- قطع الورم إلى نصفين ، وإزالة أي جلد زائد أو أوعية أو تكلس و / أو نخر.
- اختر فقط قطعا سليمة من الورم وضعها في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل وأضف 20 مل من PBS ثم انقل الأنبوب إلى غرفة منفصلة لدراسات علم الأدوية.
فئة
2. زرع تقويم البنكرياس
- التخدير والتسكين
- استخدم حقن الكيتامين 2 مل وحقن 0.42 مل زيليازين (20 ملغم/مل) ممزوجا بكمية 5.91 من ماء الحقن المعقم أو المحلول الملحي بحجم جرعة 0.06-0.1 مل/20-25 جم من وزن الجسم.
ملاحظة: وفقا لرعاية ، فإن التسكين ضروري قبل وبعد العملية. 0.05-0.1 مجم بوبرينورفين / كجم ، SC. الجرعة الأولى هي قبل العملية ثم يتم جرعتها 3 مرات كل 4 ساعات بعد العملية بشكل مستمر.
- العملية الجراحية لزراعة تقويم العظام
- تخدير الفئران عن طريق الحقن العضلي (IM). تخدير المتلقي بنسبة 5٪ من الأيزوفلوران ، والذي يتم الحفاظ عليه بواسطة مخروط الأنف عند 1٪. سيبدأ في الاسترخاء ، ويفقد رد فعله الصحيح ويصبح غير متحرك في النهاية. في عمق التخدير هذا ، يمكن إيقاظها بسهولة عن طريق المحفزات المؤلمة. اسمح للتخدير بالتعمق حتى تغيب هذه الاستجابات للألم.
- بعد تخدير بالكامل ، قم بتثبيت الفئران على لوحة التجربة في الوضع الجانبي الأيمن.
- حافظ على الفئران في الوضع الجانبي الصحيح. تطهير الجلد حول الطحال باليود ثم إزالة اليود بالكحول الإيثيلي بنسبة 75٪.
- ابحث عن النقطة المتوسطة للطحال وقم بعمل شق عمودي بطول 1 سم على البطن لكشف الطحال.
- اسحب جزءا من أنسجة البنكرياس تحت الطحال برفق باستخدام ملاقط مسطحة الرأس ، وقم بخياطة قطعة ورم متجانسة الفأر من فأر البذور على بنكرياس الفأر المتلقي بواسطة خياطة جراحية قابلة للامتصاص 9-0.
- أغلق البطن بخياطة حريرية 6-0 عن طريق التماس المزدوج. تحقيق التوازن عن طريق الضغط.
- بعد الانتهاء من زرع الورم ، في حالة عدم حدوث نزيف أو تسرب للأنسجة السرطانية ، احتفظ بالحيوانات في قفص دافئ.
- راقب حتى يستعيد وعيه الكافي للحفاظ على الاستلقاء القصي ؛ أعد إلى غرفة بعد الشفاء التام من التخدير. راقب الفئران الحاملة للورم عن طريق ملامسة البطن بالقرب من الطحال واختيار الفئران التي تحمل أورام تقويم العظام.
3. مراقبة صحة الفئران الحاملة للورم
- تحقق من استهلاك الماء والطعام يوميا.
- افحص مظهر الفأر بحثا عن معطف شعر غير مغطى أو كتل أو نحافة أو نفس غير طبيعي أو استسقاء.
- جس البطن للتحقق مما إذا كانت هناك أورام عفوية في الكبد أو الطحال.
- قم بوزن الفئران أسبوعيا باستخدام الميزان.
- إذا لوحظت أي من العلامات السريرية التالية ، يتم التضحية بالفئران لجمع العينات والتشريح: فقدان وزن الجسم >20٪؛ ضعف الحركة (غير قادر على الأكل أو الشرب)؛ غير قادر على الحركة بشكل طبيعي بسبب الاستسقاء الكبير وتضخم البطن؛ الجهد في التنفس.
