الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد المطبوعة مغناطيسيا بيولوجيا: طريقة للزراعة المشتركة للخلايا السرطانية والخلايا الليفية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Noel P. et al. التحضير والفحص الأيضي للثقافات الكروية المشتركة ثلاثية الأبعاد لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية. J. Vis. Exp. (2017)

يشرح هذا الفيديو الطباعة الحيوية المغناطيسية ثلاثية الأبعاد لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية المزروعة بشكل مشترك. يتم زراعة خلايا سرطان البنكرياس وخلايا الخلايا الليفية البنكرياسية المنشطة وممغنطة باستخدام مجموعة جسيمات نانوية متوافقة حيويا ، لتوليد كرويات ، تحت تأثير القوى المغناطيسية.

البروتوكول

< ص class = "jove_title" >1.Culture of Pancreas 3D Spheroids باستخدام الطباعة الحيوية المغناطيسية

1. باستخدام تقنية زراعة الأنسجة المعقمة القياسية ، زراعة الخلايا ذات الأهمية في قارورة T75 إلى التقاء 70-80٪ في وسط النمو المناسب.
   ملاحظه: عادة ، تم حصاد 5-7 × 10⁶ خلايا من قارورة T75 ملتصقة بنسبة 70-80٪. تم استخدام نوعين مختلفين من الخلايا في هذه الدراسة - Patu8902 (الخلايا السرطانية في البنكرياس) وخلايا PS1 (الخلايا النجمية البنكرياسية المنشطة). تم استزراع كلا خطي الخلايا في وسائط معهد روزويل بارك التذكاري 1640 (RPMI-1640) مع استكمال 10٪ (v / v) مصل بقري جنين (FBS) ، 1× بنسلين ستربتومايسين (p / s).
2. اغسل الخلايا مرة واحدة ب 5 مل من محلول ملحي فوسفات Dulbecco (DPBS).
3. افصل الخلايا عن السطح البلاستيكي عن طريق التربسين باستخدام 2 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية.
4. قم بإلغاء تنشيط التربسين عن طريق إضافة 8 مل من وسائط النمو إلى الخلايا المنفصلة. تجنب الإفراط في التربسين ، لأن هذا يمكن أن يؤثر سلبا على صحة / بقاء الخلايا.
5. خلايا الماصات لأعلى ولأسفل لتوليد معلق خلية واحدة وحساب كثافة الخلايا باستخدام عداد خلية آلي أو مقياس كثافة الدم.
6. في غضون ذلك ، قم بموازنة قارورة NS مع درجة الحرارة المحيطة.
7. احسب كمية الخلايا المطلوبة لبذر العدد المطلوب من الكرات (الآبار) ونقلها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. على سبيل المثال ، لزرع صفيحة بئر كاملة 96 تحتوي على 5,000 خلية / بئر ، اقتبس ما لا يقل عن 5.5 × 10⁵ خلايا.
8. اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 3 دقائق. قم بغضب المادة الطافية بعناية أو صب المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا بتركيز 1.0 × 10⁶ خلايا / مل في وسط النمو. ماصة برفق باستخدام طرف ماصة عريض مملة لتجنب القص. على سبيل المثال ، قم بتعليق 5.5 × 10⁵ خلايا في 550 ميكرولتر من وسائط النمو.
9. قم بمغنطة الكمية المطلوبة من الخلايا باستخدام NS المتوازنة (الخطوة 1.6).
   1. أضف NS مباشرة إلى تعليق الخلية في وسط النمو وحرك برفق. للحصول على وضع العلامات المغناطيسية الفعالة للخلايا ، استخدم 10 ميكرولتر NS لكل 100 ميكرولتر خلية (معلقة عند 1 × 10⁶ خلايا / مل).
      ملاحظه: لتجربة نموذجية ، قم بتسمية 5.5×10⁵ خلايا Patu8902 في 550 ميكرولتر مع 55 ميكرولتر NS و 1.1×10⁶ خلايا PS1 في 1100 ميكرولتر ، (بشكل منفصل) مع 110 ميكرولتر NS.
   2. اقلب الأنبوب برفق عدة مرات لضمان تعليق الخلية. مؤقتا ، انقل مزيج الخلية NS إلى بئر واحد من صفيحة 24 بئرا. افعل ذلك بشكل منفصل حتى يتم ممغنط كل نوع من أنواع الخلايا. قم بتغطية اللوحة واحتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة مع اهتزاز لطيف للسماح بارتباط NS بسطح الخلية.
      ملاحظه: تم تحقيق ثقافة ومقايسة الفيريات التي تبدأ إما من خلايا Patu8902 أو PS1 وحدها ، بالإضافة إلى الزراعة الكروية المشتركة التي تبدأ بكلا النوعين من الخلايا الممزوجة مسبقا قبل الطباعة على محركات الأقراص المغناطيسية بنجاح باستخدام هذه الطريقة في تجارب مستقلة. يتم وصف طريقة لتوليد كرويات للزراعة المشتركة من خلايا Patu8902 و PS2 أدناه في الخطوات اللاحقة.
10. ماصة لأعلى ولأسفل الخلايا الممغنطة برفق لخلطها بالتساوي وإعداد مزيج رئيسي يحتوي على رقم الخلية المطلوب. لبذر الكرويات ، استخدم ما مجموعه 15,000 خلية (5,000 Patu8902 + 10,000 PS1) واضبط على الحجم الإجمالي البالغ 150 ميكرولتر لكل بئر من صفيحة 96 بئرا.
    ملاحظه: يجب أن يكون الحجم النهائي الذي يتم توزيعه في كل بئر هو نفسه بغض النظر عن عدد الخلايا المستخدمة.
11. ضع صفيحة طاردة للخلايا مكونة من 96 بئرا فوق محرك كروي مغناطيسي مكون من 96 بئرا وقم بتوزيع 150 ميكرولتر من مزيج الخلايا في كل بئر. لاحظ أن الخلايا تتجمع ببطء إلى مركز البئر فوق المغناطيس. قم بتغطية اللوحة واحتضانها طوال الليل في حاضنة_CO2 بنسبة 5٪ مثبتة عند 37 درجة مئوية مع استمرار توصيل محرك الأقراص الكروي المغناطيسي. قم بإزالة المحرك المغناطيسي واحتضانه لمزيد من النمو لمدة تصل إلى 7 أيام.
    ملاحظه: من الأهمية بمكان استخدام ألواح النمو الطاردة للخلايا للطباعة الكروية باستخدام محركات كروية مغناطيسية. تأكد من استخدام محرك الأقراص الكروي ذو المغناطيس الأصغر الرقيق ، وليس محرك التثبيت
12. راقب نمو الكرويات كل يوم. قم بالتجديد بوسائط نمو جديدة كل ثلاثة أيام عن طريق وضع لوحة النمو المثبتة على محرك التثبيت المغناطيسي بزاوية واستخدام ماصة متعددة القنوات لسحب الوسائط المستهلكة.
    ملاحظه: ستنمو خلايا Patu8902 و PS1 المزروعة بشكل مشترك في 15,000 خلية / بئر إلى كرويات ثلاثية الأبعاد بقطر 400-600 ميكرومتر في غضون 5-7 أيام. في هذه المرحلة ، تكون الكرويات جاهزة للتوصيف الأيضي وتقييم الأدوية والتطبيقات النهائية الأخرى.

المواد