مقايسة التدفق خارج الخلية في الأجسام الكروية ثلاثية الأبعاد: طريقة لقياس النشاط الأيضي لكرويات ورم البنكرياس

الملخص

المصدر: Noel, P., et al. التحضير والفحص الأيضي للثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد لخلايا سرطان البنكرياس والخلايا الليفية. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا البروتوكول تقنية إجراء مقايسة التدفق خارج الخلية على الكرات ثلاثية الأبعاد المتولدة من الزراعة المشتركة لخلايا سرطان البنكرياس (Patu8902) والخلايا الليفية البنكرياسية المنشطة (PS1) لقياس المسارين الرئيسيين لإنتاج الطاقة ، تحلل السكر وتنفس الميتوكوندريا.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الفحص الأيضي لكرويات ورم البنكرياس ثلاثية الأبعاد لمسارات الطاقة الحيوية باستخدام محلل التدفق خارج الخلية

ملاحظة: في هذا القسم ، يتم وصف تحليل وظائف التمثيل الغذائي للكرويات باستخدام محلل التدفق خارج الخلية مع صفائح دقيقة للفحص مصممة خصيصا للكبوتيات ثلاثية الأبعاد.

1. غسل ونقل الكرات من صفائح النمو إلى الصفائح الدقيقة للفحص الكروي.
   ملاحظه: يمكن استخدام الكرات الكروية في فحوصات التمثيل الغذائي عندما يصل قطرها إلى ~ 500 ميكرومتر.
   1. في اليوم السابق لإجراء الفحص ، قم بترطيب المسبار أو خرطوشة المستشعر باستخدام كاليفر الفحص (200 ميكرولتر / بئر) في لوحة المرافق المتوفرة واحتضانها طوال الليل (4-18 ساعة) في حاضنة رطبة (غير ثاني أكسيد الكربون₂) مثبتة عند 37 درجة مئوية.
   2. قم بإعداد وسيط الفحص المناسب لمقايسة التمثيل الغذائي المطلوب عن طريق استكمال الوسائط الأساسية (انظر جدول المواد) إما ب 2 ملي مولار من L-glutamine لمقايسة اختبار إجهاد تحلل السكر (GST) أو ب 1 ملي مولار بيروفات و 2 ملي مولار من الجلوتامين و 10 ملي مولار جلوكوز لمقايسة اختبار إجهاد الميتوكوندريا (MST><). ملاحظه: يقيس محلل التدفق خارج الخلية كلا من تنفس الميتوكوندريا (OCR) وتحلل السكر (ECAR) للخلايا الحية في شكل لوحة 96 بئرا. توفر هذه المعدلات نظرة عامة على وظيفة التمثيل الغذائي الخلوي في العينات قيد التحقيق. يرجى الرجوع إلى الدليل الموجود في مجموعات الفحص للحصول على إرشادات مفصلة.
   3. بعد إضافة مكملات محددة للفحص (راجع الخطوة 1.1.1) ، قم بتسخين وسط الفحص المكمل في حمام مائي بزاوية 37 درجة مئوية واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 ± 0.1 مع 0.1N هيدروكسيد الصوديوم. حافظ على الوسط دافئا حتى الاستخدام.
   4. إعادة تكوين كواشف مجموعة الفحص في وسط الفحص المعاير إلى تركيزات المخزون الموصى بها.
      ملاحظه: يتم تصنيعها عند 10 × التركيز النهائي المطلوب في الآبار. وتبلغ تركيزات مخزون الجلوكوز والأوليغومايسين و2-ديوكسي-جلوكوز (2-DG) 100 ملي مولار و100 ميكرومتر و500 ملي مولار على التوالي.
   5. راقب الكرويات في صفيحة النمو تحت المجهر الضوئي للتحقق من التشكل الكروي والتوحيد العام ؛ من حيث شكل وهيكل الكرويات.
   6. انقل لوحة النمو إلى محرك تثبيت مغناطيسي وشفط بعناية ~ 120 ميكرولتر وسط النمو. اغسل الكرويات برفق باستخدام ~ 120 ميكرولتر من وسائط الفحص الدافئة والمعايرة مسبقا ، واستنشق وكرر الغسيل مرتين. افحص الكرويات تحت المجهر مرة أخرى للتأكد من عدم غسل الكرويات.
   7. قم بإعداد الصفيحة الدقيقة للمقايسة الكروية عن طريق إضافة 180 ميكرولتر من وسائط الفحص الدافئة إلى كل بئر.
   8. اضبط الماصة الدقيقة P20 على 10 ميكرولتر وقم بتركيب طرف عريض مملل عليها. إذا لم تكن الأطراف العريضة بالملل متوفرة ، فقم بقطع أطراف أطراف الماصة العادية بمقص نظيف أو مشرط لتوسيع التجويف.
      ملاحظه: يجب أن يقلل هذا من القص ويحافظ على التشكل الكلي للكرويات أثناء نقلها إلى لوحات الفحص.
   9. استخدم سطحا دافئا (37 درجة مئوية) لنقل الكرويات. استخدم سطح عارض أفلام الأشعة السينية الدافئ بمصباح الضوء الأبيض لتحسين التباين والمساعدة في تصور الكرويات أثناء عملية النقل.
   قم
   10. بشفط كروي واحد مغسول مسبقا بعناية من لوحة نمو طارد الخلايا باستخدام ماصة دقيقة P20 مزودة بطرف تجويف عريض ونقل الكروية برفق مباشرة إلى وسط كل بئر من لوحة الفحص الكروية لإجراء الفحص الأيضي. اسمح لكل كروي بالسقوط برفق في الغرفة الدقيقة المركزية لكل بئر عن طريق الجاذبية النقية لملء لوحة الفحص.
       ملاحظه: عادة ما يستغرق الأمر من 5 إلى 8 ثوان لكل كروي يسقط في وسط البئر عن طريق الجاذبية. لا تسحب الماصة حتى تستقر الكرويات في الغرفة الصغيرة. لا تقم بإيداع الكرات في 4 آبار زاوية للوحة الفحص (A1 ، A12 ، H1 ، H12) حيث سيتم استخدامها كآبار خلفية.
   11. راقب مورفولوجيا وموضع كل كروي للتأكد من أن كل كروي في وسط كل بئر. إذا لزم الأمر ، قم بتغيير وضعه إلى مركز البئر عن طريق شفط الأنبوب الكروي باستخدام طرف ماصة عريض التجويف ، والترسيب اللاحق عن طريق الجاذبية.
   12. بمجرد نقل جميع الكرات ، ضع لوحة الفحص في حاضنة هواء رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية (غير CO₂) لمدة ساعة واحدة قبل الفحص.
2. تحميل خرطوشة الاستشعار بالمركبات وإجراء الفحص
   1. قم بإعداد كواشف محددة للفحص المركز 10× في وسائط الفحص المحددة الموصوفة في الخطوة 1.1.2. على سبيل المثال ، لإجراء ضريبة السلع والخدمات ، أعد تكوين الجلوكوز والأوليغومايسين و 2-DG في الأحجام الموصى بها المشار إليها في دليل الفحص. تم إجراء كل من فحوصات GST و MST باستخدام كرويات Patu8902-PS1.
   2. قم بتوجيه خرطوشة المستشعر بشكل صحيح باستخدام صفوف تحمل علامة A-H على الجانب الأيسر وضع دليل تحميل أعلى خرطوشة المستشعر. تأكد من التحميل الصحيح للمنفذ المطلوب عن طريق توجيه دليل التحميل بحيث يكون الحرف المقابل للمنفذ المراد تحميله في الزاوية العلوية اليسرى.
   3. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتوزيع الكواشف مباشرة في منافذ الحقن. امسك أدلة التحميل في موضعها باستخدام أطراف الأصابع طوال الإجراء.
      ملاحظه: سيتم حقن كل كاشف في منفذ موصى به المشار إليه في دليل الفحص. تجنب تكوين فقاعات هواء ولكن لا تنقر على أي جزء من الخرطوشة لإزالة فقاعات الهواء.
   4. قم بإزالة دليل التحميل ووضعه على مستوى العين باستخدام الخرطوشة لفحص منافذ الحقن بصريا للتحميل المتساوي.
   5. قم بإنشاء بروتوكول تصميم / أداة الفحص التجريبي باستخدام برنامج Wave لوحدة التحكم في الأجهزة (من الآن فصاعدا ، برنامج التحليل) كما هو موضح في القسم 1.3.
3. تصميم الفحص وتنفيذه باستخدام برنامج التحليل
   1. إنشاء قالب فحص للتجربة
      1. افتح برنامج التحليل وانقر فوق "القوالب" أو اختر من قالب فحص موجود. انقر نقرا مزدوجا فوق "قالب فارغ".
      2. تحديد المجموعات والظروف التجريبية.
         1. تحديد استراتيجيات الحقن للمنافذ A وB وC. اترك المنفذ D فارغا.
            ملاحظه: بالنسبة لمقايسة ضريبة السلع والخدمات ، سيتم تحميل هذه المنافذ فقط بالجلوكوز والأوليغومايسين و 2-DG. في حالة اختبار MST ، سيتم تحميل oligomycin و FCCP و rotenone.
         2. تحديد المعالجات المسبقة إذا عولجت الكرويات بواحد أو أكثر من مركبات الاختبار والمجموعة الضابطة. حدد وسائط الفحص لتشمل المصدر والملاحق والمعلومات الأخرى.
         3. حدد نوعا واحدا أو أكثر من أنواع الخلية (على سبيل المثال Patu8902 ، PS1) مع رؤية معلومات الكثافة ورقم الممر.
      3. انقر فوق "إنشاء مجموعات".
      4. انقر فوق علامة التبويب "خريطة اللوحة" وقم بتعيين مجموعات للوحة الفحص المقابلة للتصميم التجريبي.
      5. حدد آبار الزوايا الأربعة كآبار خلفية. تأكد من عدم وجود كرويات في هذه الآبار.
4. تشغيل الفحص على المحلل
   1. انقر فوق علامة التبويب بروتوكول الأداة. احتفظ بأوامر البروتوكول الافتراضية عن طريق تحديد "معايرة" و "توازن" و "دورة قياس خط الأساس".
   2. انقر فوق "الحقن" وحدد مركبا لكل منفذ. قم بتحرير دورات القياس إلى 6 دورات من 3 دورات افتراضية للمركبات الكروية. احتفظ بالمزيج الافتراضي لمدة 3 دقائق ، و 0 دقيقة انتظار ، و 3 دقائق من مرات القياس.
      ملاحظه: أوقات قياس الانتظار والانتظار الافتراضية هي 3 دقائق و 0 دقيقة و 3 دقائق على التوالي. عادة ما يتم أخذ ثلاثة قياسات للمعدل القاعدي قبل حقن مركب الفحص الأول. يمكن معايرة هذه القياسات وإعادة تعديلها وفقا للتصميم التجريبي.
   3. بروتوكول المراجعة وملخص المجموعة.
   4. حفظ قالب تصميم الفحص.
   5. انتقل إلى المعايرة المسبقة للفحص بمجرد تحميل منافذ الحقن بركائز الفحص. انقل الخرطوشة باستخدام لوحة المرافق إلى محلل التدفق خارج الخلية.
      ملاحظه: يكتمل هذا عادة في غضون 15-20 دقيقة ويقوم بمعايرة المستشعرات لإجراء قياسات التعرف الضوئي على الحروف و ECAR.
   6. بعد معايرة الخرطوشة ، استبدل لوحة المرافق بلوحة الفحص الدافئة مسبقا التي تحتوي على كرويات ثلاثية الأبعاد وابدأ المقايس. بعد اكتمال القياسات ، قم بتصدير البيانات إلى جدول البيانات أو الرسوم البيانية والبرامج الإحصائية لتحليل البيانات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 96 لوحة طارد خلية جيدة الولايات المتحدة الأمريكية العلمية / جرينر بيو ون 655970 لوحة نمو كروية د-جلوكوز سيغما د9434 DPBS جيبكو 14190-144 طقم اختبار إجهاد تحلل السكر تقنيات Agilent 103020-100 ل-جلوتامين سيغما 59202ج طقم اختبار إجهاد الميتوكوندريا تقنيات Agilent 103015-100 خلايا Patu8902 مخزون المختبر خلايا السرطان الغدي الأقنية في البنكرياس خلايا PS1 مخزون المختبر الخلايا النجمية البنكرياسية المنشطة RPMI1640 جيبكو 11875-093 وسائط النمو للخلايا والكرويات SeaHorse XFe 96 محلل التدفق خارج الخلية تقنيات Agilent محلل التدفق خارج الخلية بيروفات الصوديوم سيغما إس 8636 وسائط XF الأساسية تقنيات Agilent هاتف: 102365-100 الوسائط الأساسية لفحوصات التمثيل الغذائي على XFe 96