مقالة منهجية

عزل الخلايا الجذعية PDAC: طريقة لعزل الخلايا الجذعية السرطانية من أورام البنكرياس

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Lonardo, E., et al. دراسة خصائص الخلايا الجذعية لسرطان البنكرياس لتطوير استراتيجيات علاج جديدة. J. Vis. Exp. (2015).

توضح هذه المقالة تقنية عزل الخلايا الجذعية لسرطان البنكرياس (CSCs) من أنسجة السرطان الغدي الأقنية في البنكرياس البشري (PDAC). تستخدم هذه الخلايا الجذعية الدماغية لدراسة التأثيرات الوظيفية للعلاج بالعقاقير على قدرة التجديد الذاتي في المختبر لمراكز الدم السرطانية لتطوير علاجات أكثر كفاءة للسرطان.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. عزل CSCs عن PDAC البشري (الشكل 1)

  1. في خزانة السلامة الحيوية المعقمة ، انقل أنسجة PDAC البشرية إلى طبق استزراع مقاس 60 × 15 مم يحتوي على 1 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات 1X (PBS). افرم الورم إلى قطع صغيرة (1-5 مم) باستخدام مشرط معقم وملقط.
  2. أضف 1 مل من 1X PBS المعقم إلى طبق الثقافة وكرر خطوة التخلي حتى يتم فصل الأنسجة تماما ، وهذا يتطلب بانتظام 3-4 جولات. انقل تعليق الأنسجة (أعلى من الحجم النهائي 5 مل مع 1X PBS) إلى أنبوب معقم وقم بتجانسه ميكانيكيا باستخدام مفكك مثل gentleMACS.
  3. احتضان الأنسجة المتجانسة بالكولاجيناز (استخدم 2.5 مجم / مل من الكولاجيناز في 1X PBS) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 900 × جم. صب المادة الطافية وأعد تعليق كريات الخلية في 10 مل من الوسط الكامل. قم بتصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة 40 ميكرومتر وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 900 × جم.
  4. صب المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات مع 5 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (كلوريد الأمونيوم والبوتاسيوم ، ACK) ، واحتضان
  5. أعد تعليق الحبيبات في وسط CSCs ، وقم بوضعها على طبق مغطى بالجيلاتين ، واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ستزيل هذه الخطوة معظم خلايا الخلايا الليفية التي تلتصق بسرعة باللوحة.
  6. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة واسترجع تعليق الخلية بعناية وحدد عدد الخلايا القابلة للحياة (التريبان السلبي الأزرق) باستخدام مقياس كثافة الكريات. لهذا الغرض ، قم بخلط التعليق والماصة برفق 20 ميكرولتر من التعليق في أنبوب Eppendorf. أضف 20 ميكرولتر (نسبة 1: 1) من التريبان الأزرق إلى الخلايا الموجودة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق واخلطه جيدا. الماصة حوالي 10 ميكرولتر من الخليط على مقياس كثافة الدم.
  7. احسب جميع الخلايا الواضحة داخل أرباع الزوايا الأربعة لغرفة العد لعدد الخلايا القابل للحياة.
    ملاحظه: قد تختلف صلاحية الخلايا وإنتاجيتها اختلافا كبيرا بين عينات الورم. بالنسبة لعينات PDAC ، تتراوح الجدوى بانتظام بين 45-70٪ ، ويجب أن تنتج قطع الأنسجة من عينة الورم العيانية التي يبلغ قطرها 3-5 مم إلى ما يقرب من 5 × 106 خلايا قابلة للحياة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1. يستهدف الميتفورمين بشكل انتقائي CSCs.< / > (أ) قلل الميتفورمين من حجم المجالات. صور تمثيلية للكرات التي تم الحصول عليها بعد العلاج بالجرعات المحددة من الميتفورمين لمدة 7 أيام (اللوحة اليمنى). القياس الكمي لحجم الكرة (n≥6) (اللوحة اليسرى) ، تمثل الأرقام المشار إليها في محور الخراجات الورم الفردي. (ب) قدرة تكوين الكرة في وجود أو عدم وجود الميتفورمين لمد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات غرفة العد /
مقياس الدم شركة هوسر العلمية 3200 دق عداد ومحلل خلايا CASY لقياس الانتشار والجدوى روش إنوفاتيس AG CASY موديل TTC 45،60،150 ميكرومتر GentleMACS Dissociator شركة ميلتيني 130-093-235 أنابيب GentleMACS C شركة ميلتيني 130-093-237 أطباق زراعة المناديل 100 مم بي دي فالكون 353803 مصفاة الخلية بي دي فالكون هاتف: 352350 أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلين سعة 15 مل بي دي فالكون 352097 أنبوب مخروطي بولي بروبلين سعة 50 مل بي دي فالكون 352070 1.5 مل أنابيب معقمة إيبندورف 0030 120.086 أنابيب الطرد المركزي 50 مل كورنينج 430828 أطباق بتري معقمة ، أطباق 10 سم كورنينج 353003 الكولاجيناز النوع الرابع تقنيات الخلايا الجذعية 7909 RPMI متوسط 1640 تقنيات الحياة 11875-085 محلول البنسلين / الستربتومايسين ، 100X تقنيات الحياة SV30010 ل-جلوتامين، 200 ملم، 100X تقنيات الحياة هاتف: 25030-081 ملحق B27 50x تقنيات الحياة 17504-044 عامل نمو الخلايا الليفية الأساسي سيغما F0291 Dulbecco's Modified Eagle Medium / F12 سيغما د8437 معقم 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco سيغما د8537 تريبان بلو تقنيات الحياة 15250-061 حاضنة مع مدخلات CO2 مقص صغير ملقط منحني ملقط منشق

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ACK

مقالات ذات صلة