مقايسة تكوين الكرة: طريقة في المختبر لتحديد الخلايا الجذعية لسرطان البنكرياس وعلاجات الفحص

الملخص

المصدر: Lonardo، E. et al. دراسة خصائص الخلايا الجذعية لسرطان البنكرياس لتطوير استراتيجيات علاج جديدة. J. Vis. Exp. (2015).

يوضح هذا الفيديو بروتوكول تطوير الخلايا الجذعية لسرطان البنكرياس في المختبر. يمكن أن يكون الاختبار بمثابة أداة فحص لتحديد المركبات التي يحتمل أن تستهدف الخلايا الجذعية السرطانية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1.Sphere تشكيل الفحص والتحليل

1. مقايسة تكوين الكرة وعلاج الميتفورمين
   1. خذ العدد المطلوب من الخلايا وأضف الحجم المناسب من وسط الخلايا الجذعية الدماغية لتحضير تركيز خلية يبلغ 2,000 خلية / مل. لا تبقي تعليق الخلية على الجليد لمدة لا تزيد عن 1 ساعة وتخلط جيدا قبل الطلاء.
   2. أضف 500 ميكرولتر من 1X PBS إلى الصف الأول والأخير من صفيحة 24 بئرا للترطيب للمساعدة في تقليل التبخر المتوسط. زرع الخلايا في صفائح خلايا ملحقة منخفضة للغاية بكثافة 2,000 خلية لكل بئر في 1 مل من وسط كرة الورم (2,000 خلية / مل).
      ملاحظه: قد يختلف عدد الخلايا المستخدمة في فحوصات تكوين كرة الورم بين أنواع الأورام.
   3. عالج ما لا يقل عن 4 آبار بمركبة (تحكم سلبي) و 4 آبار مع كل معالجة مخصصة ، على سبيل المثال ، 3 ملي مولار من الميتفورمين. ضع الخلايا في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية وقم بتزويد الخلايا ب 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة أسبوع واحد.
      ملاحظه: لا ينبغي تغيير الوسط للسماح بالتكوين غير المضطرب لمجالات الورم ، ولكن يمكن تعبئته بعوامل النمو على أساس يومي لأنها غير مستقرة في وسط الاستزراع.
   4. أضف العلاج كل يومين ، على سبيل المثال ، 3 ملي مولار من الميتفورمين أو السيارة إلى كل بئر. قم بتقييم عدد مجالات الورم المشكلة بعد 5 و / أو 7 أيام باستخدام عداد الخلايا الآلي الذي يسمح بحساب الهياكل الأكبر (الشكل 1).
      ملاحظه: يجب مراعاة مجالات الورم التي لا تقل عن 40 ميكرومتر فقط ويمكن تصنيفها على أنها صغيرة (40-80 ميكرومتر) أو كبيرة (80-120 ميكرومتر) ، على التوالي. يمكن توضيح النتائج على أنها النسبة المئوية لمجالات الورم مقسومة على العدد الأولي للخلايا المزروعة (على سبيل المثال ، 2,000 خلية).
2. المرور التسلسلي لمجالات الورم من الجيل الأول
   1. بعد 7 أيام من الحضانة ، قم بحصاد كرات الورم باستخدام مصفاة خلية 40 ميكرومتر وقم بطردها لمدة 5 دقائق عند 900 × جم في RT.
   2. قم بفصل حبيبات كرات الورم إلى خلايا مفردة باستخدام التربسين ، ثم قم بتوسيع تعليق خلايا الخلية المفردة التي تم الحصول عليها مرة أخرى لمدة 7 أيام أخرى.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. يمنع علاج الميتفورمين استهلاك الأكسجين ويحفز إنتاج ROS. (أ) بالإضافة إلى ذلك يمنع الميتفورمين استهلاك الأكسجين (OCR) للخلايا المشتقة من الكرة. تمت معالجة مجالين ثانويين مختلفين من PDAC بالميتفورمين وتم قياس تغيرات التعرف الضوئي على الحروف عن طريق تحليل التدفق خارج الخلية. تم استخدام حقن الروتنون كعنصر تحكم في إجمالي استهلاك التعرف الضوئي على الحر...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 24 بئر لوحات التثبيت منخفضة للغاية كورنينج 3474 معقم 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco سيغما د8537 ميتفورمين سيغما D150959-5 جرام محلول التربسين ، 0.05٪ تقنيات الحياة 25300054 حاضنة مع مدخلات CO2 عداد ومحلل خلايا CASY لقياس الانتشار والجدوى روش إنوفاتيس AG CASY موديل TTC 45،60،150 ميكرومتر غرفة العد / مقياس الدم شركة هوسر العلمية 3200 دق أنابيب الطرد المركزي 50 مل كورنينج 430828 أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبلين سعة 15 مل بي دي فالكون 352097 أنبوب مخروطي بولي بروبلين سعة 50 مل بي دي فالكون 352070