مراقبة البيئة المكروية للورم القائمة على PTM: طريقة لتتبع التغييرات في صلابة ECM باستخدام كرويات الورم

الملخص

المصدر: جونز ، دي بي ، وآخرون. القياس الطولي لصلابة المصفوفة خارج الخلية في نماذج الورم ثلاثية الأبعاد باستخدام علم الريولوجيا الدقيقة لتتبع الجسيمات. J. Vis. Exp. (2014).

يصف هذا البروتوكول تقنية لمراقبة تغيرات صلابة المصفوفة خارج الخلية باستخدام علم الريولوجيا الدقيقة لتتبع الجسيمات (PTM). يتم ذلك عن طريق زراعة كرويات ورم البنكرياس ثلاثية الأبعاد في ECM باستخدام مجسات فلورية مدمجة لتتبع وتحليل جسيمات الفيديو.

البروتوكول

فئة

1. تحضير كرويات الورم ثلاثية الأبعاد المضمنة في ECM

1. قم بإعداد محطة عمل بالمواد اللازمة داخل غطاء التدفق الرقائقي.
2. قم بإعداد خليط مخفف من مجسات تتبع الفلورسنت المعدلة بالكربوكسيل بقطر 1 ميكرومتر عن طريق إضافة جزأين من مجسات المخزون (2٪ مواد صلبة) إلى 25 جزءا من الماء المعقم.
3. أخرج زجاجة تحتوي على 3.1 مجم / مل من الكولاجين البقري من الثلاجة وضعها على الثلج.
4. Aliquot 125 ميكرولتر من الكولاجين في قارورة فارغة سعة 2 مل.
5. أضف 50 ميكرولتر من محلول مسبار التتبع المخفف إلى القارورة التي تحتوي على الكولاجين والدوامة لفترة وجيزة لتوزيع المجسات.
6. أضف 235 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا المناسبة التي تحتوي على الفينول الأحمر (الذي سيتحول إلى اللون الأصفر) لحجم إجمالي يبلغ 410 مل ودوامة لفترة وجيزة قبل إزالة 205 مل (نصف الحجم الإجمالي) ووضعها في قارورة جديدة سعة 2 مل. ستحتوي القارورة 1 على الورم الكروي وستكون القارورة 2 خليطا تحكميا.
7. أضف ~ 2 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم إلى القارورة 1 لإعادة المحلول إلى درجة الحموضة المحايدة (يجب أن تعود وسائط الثقافة التي تحتوي على الفينول الأحمر إلى اللون الأحمر). لاحظ أن هذا سيؤدي إلى بدء الخليط في المعالجة إذا لم يتم حفظه على الثلج. دوامة لفترة وجيزة للخلط ، ثم العودة إلى رف الثلج على الفور.
   ملاحظه: بالكاد يمكن رؤية الكروية بالعين المجردة بعد 9 أيام من الثقافة وإزالتها من فراش الاغاروز مهمة حساسة. قد يكون استخدام مجهر التشريح مفيدا لبعض المستخدمين. يعد الحفاظ على سلامة الكرة الكروية أثناء النقل أمرا بالغ الأهمية.
8. باستخدام طرف ماصة واسع الفم، قم بإزالة 40 ميكرولتر من الوسائط برفق من البئر التي تحتوي على الورم الكروي. احتفظ بهذا 40 ميكرولتر أثناء إجراء الخطوة التالية.
9. تحقق من البئر لمعرفة ما إذا كان قد تمت إزالة الكروية في الخطوة السابقة. إذا كان الأمر كذلك ، أضف 40 ميكرولتر الذي يحتوي على الكرة الكروية إلى القارورة 1. إذا لم يكن الأمر كذلك ، ضع 40 ميكرولتر مرة أخرى في البئر وكرر الخطوة السابقة.
10. حرك القارورة 1 برفق (لا تخاطر بالدوامة ، فقد تتلف الكرة الكروية) قبل نقل الخليط في أجزاء 60 ميكرولتر إلى ثلاثة آبار منفصلة من صفيحة 96 بئرا. افحص كل بئر بالمجهر بعد إضافة الخليط لتحديد البئر الذي يحتوي على الكروي.
11. أضف ~ 2 ميكرولتر 1 م هيدروكسيد الصوديوم و 40 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا إلى القارورة 2 والدوامة قبل نقل 60 ميكرولتر من هذا الخليط إلى بئر فارغ في الصفيحة المكونة من 96 بئرا ووضع العلامات عليها كعنصر تحكم.
12. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية للعلاج لمدة 1 ساعة على الأقل.

2. قم بإنشاء شبكة من نقاط العينة والتقط مقطع فيديو في كل نقطة

1. انقل لوحة العينة من الحاضنة إلى مرحلة المجهر. اترك 10 دقائق حتى تتوازن العينة مع درجة حرارة الغرفة في حالة عدم توفر مرحلة ساخنة.
2. راقب العينة بعدسات موضوعية منخفضة الطاقة للتأكد من أنها سليمة وجاهزة للتصوير. تحديد موضع الورم داخل البئر.
3. حدد عدد النقاط العينة التي يجب اتخاذها. عادة ما ينتج عن 20 نقطة عينة في كل بئر ، موزعة في حلقات متحدة المركز حول الكروي نتائج مفصلة بشكل كاف.
4. انقل المرحلة إلى كل موضع مطلوب واستخدم برنامج الربط المجهري لتسجيل إحداثيات x و y (أو تسجيل الإحداثيات يدويا إذا كان برنامج الربط غير متوفر).
5. قم بتبديل المجهر إلى عدسة موضوعية عالية الطاقة (عادة 100X) ، وحدد مكعب المرشح المناسب للطول الموجي للإثارة لمجسات التتبع. استخدم قائمة النقاط التي تم إنشاؤها في الخطوة 2.4 للانتقال إلى النقطة الأولى في الشبكة.
6. اضبط التركيز للعثور على قاع البئر ، ثم تحرك لأعلى للعثور على مجال رؤية (fov) يحتوي على العديد من مجسات التتبع في التركيز البؤري.
7. راقب الرسم البياني للشدة واضبط شدة التعريض الضوئي والوقت لإعطاء أكبر نطاق ديناميكي ممكن مع التأكد من عدم تشبع الصورة.
8. الحصول على تسلسل فيديوي بمعدل إطارات يتراوح بين 20 و30 مللي ثانية لكل رتل (يوصى بطول 800 رتل تقريبا أو 24-16 ثانية لتوفير إحصاءات كافية لحساب MSD القوي متوازن مع الحاجة إلى تقليل وقت الاقتناء إلى أدنى حد ممكن في كل نقطة شبكة مكانية) والحفظ باصطلاح مناسب. أثناء التسجيل ، لا تلمس المجهر أو الطاولة.
9. كرر الخطوات من 2.6 إلى 2.9 لكل نقطة عينة في الشبكة.
10. كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.10 لكل بئر في التجربة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكولاجين البقري من النوع 1 BD Biosciences ، سان خوسيه ، كاليفورنيا 354231 PANC-1 ثقافة الخلايا من النوع الأمريكي ، ماناساس ، فيرجينيا CRL1469 أو نوع خلية مناسب آخر الكريات المجهرية الفلورية لايف تكنولوجيز ، كارلسباد ، كاليفورنيا 906906 أغاروز فيشر الكواشف الحيوية ، والثام ، ماساتشوستس C12H18O9 هيدروكسيد الصوديوميوم فيشر الكواشف الحيوية ، والثام ، ماساتشوستس NC0480985 لوحات تصوير 96 بئر شركة كورنينج ، كورنينج ، نيويورك 3904 DMEM هيكلون ، والثام ، ماساتشوستس SH30243.01 أو وسائط زراعة الخلايا المناسبة مجهر زايس أكسيو أوبسيفر زايس ، أوبركوتشين ، ألمانيا يتضمن كاميرا عالية السرعة وبرامج تصوير