الكشف عن أنواع الأكسجين التفاعلية باستخدام تلطيخ DCFH-DA: قياس إجمالي أنواع الأكسجين التفاعلية في خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم

الملخص

المصدر: Kim, H., et al. الكشف عن إجمالي أنواع الأكسجين التفاعلية في الخلايا الملتصقة عن طريق تلطيخ ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلورسين ثنائي الأسيتات. J. Vis. Exp. (2020).

يصف هذا الفيديو بروتوكول الكشف عن إجمالي أنواع الأكسجين الخلوي التفاعلي (ROS) باستخدام ثنائي خلو ثنائي هيدروفلوريسين ثنائي الأسيتات 2',7'-dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA). تساعد هذه الطريقة في تصور توطين ROS في الخلايا الملتصقة باستخدام مجهر مضان وتحديد كثافة ROS بشكل أكبر باستخدام قارئ لوحة فلورة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. بذر الخلايا

1. بذرة 2 × 10⁵ خلايا سرطان القولون والمستقيم HCT116 لكل بئر في صفيحة 24 بئرا والحفاظ على الخلايا في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
2. يستعاض عن وسط الاستزراع ب أو بدون كبريتات الحديدوز 100 ميكرومتر (FS) أو 10 ميكرومتر دوكسوروبيسين (DOX) المحتوية على وسط واحتضانه لمدة 24 ساعة.

2. إعداد حل DCFH-DA

1. قم بإذابة 4.85 مجم من DCFH-DA في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لعمل محلول مخزون 10 ملم.
قم
2. بتخفيف محلول المخزون باستخدام DMEM الدافئ مسبقا في محلول عمل 10 ميكرومتر قبل إضافته إلى الآبار مباشرة.
3. دوامة الحل العملي لمدة 10 ثوان.

فئة

3. تلطيخ DCFH-DA

1. قم بإزالة الوسيط المحتوي على الدواء واغسله مرة واحدة باستخدام DMEM.
2. أضف 500 ميكرولتر من محلول عمل DCFH-DA في كل بئر واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
3. قم بإزالة حل عمل DCFH-DA. يغسل مرة واحدة باستخدام DMEM و 2x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS).
4. أضف 500 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر.

< p class = "jove_title" >4. اكتساب التصوير وقياس الشدة

1. التقط صورا فلورية تمثيلية لكل بئر باستخدام قناة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) على المجهر الفلوري.
2. بعد التقاط الصور ، قم بإزالة PBS وأضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لمقايسة الترسيب المناعي المشع (RIPA) إلى كل بئر.
3. احتضن على الجليد لمدة 5 دقائق ، ثم اجمع محللات الخلايا في أنابيب سعة 1.5 مل.
4. جهاز طرد مركزي عند 21,130 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
5. انقل 100 ميكرولتر من المادة الطافية إلى صفيحة سوداء ذات 96 بئرا وقم بقياس شدة التألق باستخدام قارئ صفيحة دقيقة مضان بطول موجي إثارة يبلغ 485 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 530 نانومتر.
6. انقل 1 ميكرولتر من المادة الطافية إلى صفيحة شفافة مكونة من 96 بئرا تحتوي على 100 ميكرولتر من محلول فحص البروتين 1x لقياس تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد.
7. تطبيع شدة التألق بتركيزات البروتين.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 2',7'-ثنائي كلورو فلورسين أسيتات كايمان كيميكال ، آن أربور ، ميشيغان هاتف 20656 دوكسوروبيسين هيدروكلوريد TCI أمريكا ، بورتلاند ، أو د4193-25 ملغ وسط النسر المعدل من Dulbecco كورنينج ، كورنينج ، نيويورك 45000-304 نظام التصوير التلقائي Invitrogen EVOS FL ثيرمو فيشر العلمي والثام ، ماساتشوستس AMAFD1000 أو أي مجهر مضان آخر محلول فحص البروتين برادفورد بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا 5000001 قارئ الصفيحة الدقيقة SpectraMax M2 الأجهزة الجزيئية ، رادنور ، بنسلفانيا 89429-532 أو أي قارئ صفيحة مضان آخر كبريتات الحديدوز هيبتاهيدرات VWR ، رادنور ، بنسلفانيا 97061-542