استخراج الحمض النووي الريبي المتداول: طريقة لعزل الحمض النووي الريبي المرسال من عينات البلازما عن طريق الاستخراج العضوي وتخصيب الحمض النووي الريبي الصغير

Abstract

المصدر: Canale ، M. et al. ، الكشف عن لوحة مخصصة للحمض النووي الريبي الميكروي المنتشرة في المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم النقيلي. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو استخراج الحمض النووي الريبي الصغير المتداول من عينات البلازما لمرضى سرطان القولون والمستقيم باستخدام الاستخراج العضوي متبوعا بتخصيب عمود الألياف الزجاجية. miRNAs مستقرة في السوائل البيولوجية مثل المصل والبلازما ، مما يجعلها مؤشرات حيوية مثالية للدوران لتشخيص السرطان والتشخيص واتخاذ قرارات العلاج ومراقبته. ستساعد هذه الطريقة في تحديد المؤشرات الحيوية المنتشرة الجديدة القادرة على التنبؤ بالنتائج السريرية لدى المرضى.

Protocol

< p class = "jove_content" >ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات التالية تحت غطاء الدخان المعقم وفقا لممارسات المختبر الجيدة (GLP).

< p class = "jove_title" >1. جمع البلازما وتخزينها

1. اجمع 3 مل من عينة الدم المحيطية في أنبوب K3E EDTA.
2. جهاز الطرد المركزي للأنبوب في درجة حرارة الغرفة عند 1,880 × جم لمدة 15 دقيقة.
3. استعادة البلازما الطافية في حصص 450 ميكرولتر.
4. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
   ملاحظة: قم بمعالجة أنبوب الدم المحيطي في غضون 2 ساعة من التجميع. عند استعادة البلازما من الأنبوب ، لا تزعج طبقة الخلايا الليمفاوية.

2. استخراج miRNAs المنتشرة من عينات البلازما

1. تحضير جميع المحاليل المطلوبة وإذابة العينات لخطوات الاستخراج.
   1. أضف 375 ميكرولتر من 2-mercaptoethanol إلى محلول تغيير طبيعة 2x واخلط جيدا.
   2. أضف 21 مل من الإيثانول من الدرجة 100٪ من ACS إلى محلول غسيل miRNA I واخلطه جيدا.
   3. أضف 40 مل من الإيثانول ACS 100٪ إلى محلول الغسيل 2/3 واخلطه جيدا.
   4. اسمح لكمية البلازما بالذوبان في درجة حرارة الغرفة ثم ابدأ خطوات الاستخراج.

2. الاستخراج العضوي
   1. انقل 400 ميكرولتر من عينة البلازما إلى أنبوب 2 مل خال من RNase.
   2. أضف 400 ميكرولتر من محلول تغيير طبيعة 2x ، واخلطه عن طريق الدوامة وجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة.
   3. أضف 4 ميكرولتر من 1 نانومتر ، واخلطها عن طريق الدوامة وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
   4. أضف 800 ميكرولتر من حمض الفينول - كلوروفورم.
   5. دوامة لمدة 60 ثانية وجهاز طرد مركزي بأقصى سرعة (≥10,000 × جم) لمدة 15 دقيقة.
   6. انقل المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب جديد. لا تزعج الطور البيني. لاحظ الحجم الذي تم استرداده وتخلص من الأنبوب الذي يحتوي على الطور غير المائي.
      ملاحظه: يتم تخزين محلول تغيير الطبيعة 2x عند 4 درجات مئوية وقد يتجمد عند درجة الحرارة هذه. قبل الاستخدام ، قم بتسخين المحلول إلى 37 درجة مئوية ، مع التقليب من حين لآخر لمدة 10-15 دقيقة. احرص على سحب المرحلة السفلية التي تحتوي على حمض الفينول الكلوروفورم ، وليس المخزن المؤقت المائي الموجود فوق الخليط. سخن محلول الشطف أو الماء الخالي من النوكلياز إلى 95 درجة مئوية. احرص على تسخين حجم مناسب من المحلول (100 ميكرولتر لكل عينة + 10٪ فائض).

قيمة
1. تخصيب الحمض النووي الريبي الصغير
   1. أضف 1/3 حجم من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى المرحلة المائية من الخطوة 2.2.6 واخلطه جيدا.
   2. ضع خرطوشة الفلتر في أنبوب تجميع جديد لكل عينة.
   3. انقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من المحللة من الخطوة 2.3.1 والإيثانول إلى خرطوشة المرشح وجهاز الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 30 ثانية.
   4. إذا كان هناك >700 ميكرولتر من الخليط المتبقي ، ضع المرشح في أنبوب جديد وكرر الخطوة 2.3.3 ؛ كرر حتى يمر الخليط بالكامل عبر خرطوشة الفلتر.
   5. قم بقياس الحجم الكلي للتدفق.
   6. أضف 2/3 حجم من الإيثانول 100٪ للترشيح واخلطه جيدا.
   7. ضع خرطوشة فلتر ثانية في أنبوب تجميع جديد.
   8. انقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من حجم العينة إلى الخرطوشة وجهاز الطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 30 ثانية.
   9. كرر الخطوة 1.3.8 حتى يمر كل الخليط عبر خرطوشة الفلتر.
   10. ضع 700 ميكرولتر من محلول غسيل miRNA 1 على خرطوشة الفلتر وقم بالطرد المركزي لخرطوشة الفلتر باستخدام أنبوب التجميع عند 10,000 × جم لمدة 15 ثانية. ضع خرطوشة الفلتر في نفس أنبوب التجميع.
   11. ضع 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3 على خرطوشة الفلتر وقم بالطرد المركزي لخرطوشة الفلتر بأنبوب التجميع عند 10,000 × جم لمدة 15 ثانية. ضع خرطوشة الفلتر في أنبوب تجميع جديد.
   12. ضع خرطوشة الفلتر في أنبوب تجميع جديد وكرر الخطوة 2.3.11 مع 500 ميكرولتر من محلول الغسيل 2/3. تخلص من التدفق وانقل خرطوشة الفلتر إلى أنبوب تجميع جديد.
   13. الطرد المركزي الأنابيب بخراطيش الفلتر عند 10,000 × جم لمدة 1 دقيقة.
   14. انقل خرطوشة الفلتر إلى أنبوب تجميع جديد سعة 1.5 مل وأضف 100 ميكرولتر من محلول الشطف المسخن مسبقا (95 درجة مئوية) أو الماء الخالي من النوكلياز.
   15. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 30 ثانية لاستعادة miRNAs وتخزينها عند -80 درجة مئوية
       ملاحظه: قد يتشكل راسب أبيض في محلول الغسيل 2/3. هذا الراسب هو EDTA الزائد المنبعث من المحلول. تجنب سحب هذه البلورات أثناء خطوات سحب العينات.

Materials