عزل الحمض النووي الميكروبي للبراز: دراسة تأثير الإثراء البيئي على تنوع الميكروبيوم في نموذج ورم الفئران

Abstract

المصدر: فولر، إيه كيه، وآخرون. طريقة لتحديد آثار التخصيب البيئي على التنوع البيولوجي لميكروبيوم القولون في نموذج ورم القولون في الفأر. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو بروتوكول عزل الحمض النووي من عينات البراز للفئران الحاملة لورم القولون. يتم تضخيم الحمض النووي المستخرج باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، ويتم تنظيف المنتج بشكل أكبر باستخدام نهج قائم على الخرز المغناطيسي. يمكن استخدام هذه الطريقة لتحديد تأثير التخصيب البيئي على ميكروبيوتا القولون ووفيات.

Protocol

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. عزل الحمض النووي الجيني من البراز

ملاحظة: استخدم مجموعة تجارية لعزل الحمض النووي الميكروبي من البراز باتباع بروتوكول الكشف عن مسببات الأمراض في البراز. قم بإزالة العينات مباشرة من الفريزر -80 درجة مئوية وتخزينها على الثلج الجاف أثناء الوزن.

1. نقل ما يصل إلى 220 ملغ من البراز إلى أنبوب دقيق نظيف يحتوي على 1.4 مل من محلول تحلل البراز بدرجة حرارة الغرفة (RT) (انظر جدول المواد).
2. عينة دوامة لمدة 1 دقيقة لتجانس المواد الصلبة تماما (الشكل 1 ب). سخني المعلق إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتحلل جميع البكتيريا (بما في ذلك البكتيريا موجبة الجرام).
3. عينات دوامة لمدة 15 ثانية ثم أجهزة الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة 1 دقيقة لحبيبات المواد الصلبة للبراز. انقل المادة الطافية إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 2 مل. أضف قرصا واحدا إلى كل عينة لامتصاص مثبطات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وقم بالدوامة حتى يذوب الجهاز اللوحي ، واحتضان العينة في RT لمدة 1 دقيقة.
4. قم بالطرد المركزي للعينة عند 20,000 × جم لمدة 3 دقائق ونقل المادة الطافية إلى أنبوب ميكرو فيوج جديد. جهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 3 دقائق. Aliquot 15 ميكرولتر من البروتيناز K (مخزون 20 مجم / مل) في أنبوب جديد 1.5 مل من الطرد الدقيق. الماصة 200 ميكرولتر من العينة في الأنبوب الذي يحتوي على البروتيناز K.
5. أضف 200 ميكرولتر من محلول تحلل كلوريد الجوانيدينيوم إلى الأنبوب ، وقم بدوامة كاملة لمدة 15 ثانية (انظر جدول المواد) واحتضان العينة عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. أضف 200 ميكرولتر من الإيثانول (96-100٪) إلى الأنابيب واخلطها جيدا عن طريق الدوامة.
6. ضع عمود دوران قائم على السيليكا في أنبوب تجميع سعة 2 مل وقم بتطبيق العينات على العمود. أغلق الغطاء وجهاز الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة عند 20,000 × جم.
7. انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل وأضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت 1 إلى العمود ، وقم بتغطية العمود وجهاز الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة عند 20,000 × جم. انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل وأضف 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل 2 إلى العمود ، أغلق الغطاء ، وجهاز الطرد المركزي عند 20,000 × جم لمدة 3 دقائق.
8. مع إغلاق الغطاء ، انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل ، وجهاز طرد مركزي لمدة دقيقة واحدة إضافية عند 20,000 × جم لإزالة مخزن الغسيل المتبقي. انقل العمود إلى أنبوب ميكرو فوج مسمى 1.5 مل وقم بمسح العينة عن طريق إضافة 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف الذي يحتوي على EDTA إلى الغشاء (انظر جدول المواد).
9. أغلق الغطاء واحتضنه عند RT لمدة 1 دقيقة. قم بالطرد المركزي للعينة لمدة دقيقة واحدة عند 20,000 × جم.

< p class = "jove_title" >2. تحديد تركيز الحمض النووي وإعداد العينة ل PCR

< p class = "jove_content" >ملاحظة: استخدم مقياس الفلور ومقايسة الفلورسنت dsDNA المتوفرة تجاريا لتحديد تركيز الحمض النووي الجيني في كل عينة (انظر جدول المواد). يجب أن تربط صبغة الفلورسنت الحمض النووي المزدوج الشريطة على وجه التحديد.

1. قم بإعداد تخفيف 1: 200 لكل عينة (1 ميكرولتر من كل عينة في 199 ميكرولتر من مزيج dsDNA) وتخفيف 1:50 للمعايير. قم بالتحليل على مقياس الفلور باستخدام إعداد dsDNA.
   ملاحظة: يمكن أن يكون الحجم الكبير من الحمض النووي في تفاعل البوليميراز المتسلسل مثبطا ، وبالتالي ، يجب ألا يزيد حجم الحمض النووي المستخدم عن 10٪ من الحجم النهائي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتيح مقياس الفلور القياس الدقيق للحمض النووي في العينة ، حيث أن الحمض النووي المرتبط بصبغة الفلورسنت فقط هو الذي يتألق ، مما يلغي المساهمة المحتملة للملوثات في تركيز الحمض النووي النهائي المحسوب. هذا المستوى من القياس الكمي الدقيق ضروري لتطبيق التسلسل النهائي.
2. قم بإعداد قوالب PCR مخففة إلى 5 نانوغرام / ميكرولتر بالحجم المناسب 10 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 8.5 لعمل مخزون قوالب العمل لكل عينة.
3. تخزين العينات في -20 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >3. تصميم الاشعال لمناطق V المطلوبة 16S

1. صمم بادئات لتضخيم مناطق V 16S rRNA المطلوبة بشكل انتقائي.
2. قم بتحليل الاشعال باستخدام Probe Match ، من مشروع قاعدة بيانات الريبوسومات ، لتحديد معدل النجاح التقريبي لمختلف شعبة.
   ملاحظة: بالنسبة لمناطق V1-V3 ، استخدمت الدراسة الحالية بادئات منشورة Bosshard forward ، والتي ترتبط في الموضع 8 داخل منطقة V1 ، و 533 للخلف ، والتي ترتبط في الموضع 533 داخل منطقة V3. يجب أن تتضمن البادئات تسلسلات محول متدلي للفهرسة.
3. عند تصميم البادئات ، قم بتضمين تسلسلات المحول في نهايات 5 'من كل برايمر ، على النحو الموصى به لإعداد مكتبة تسلسل الميتاجينوميات 16S (الجدول 1).
4. قم بتجميع هذه الاشعال الكبيرة مع تنقية الخرطوشة. أعد تكوين البادئات المجففة وتخفيف مخزون عمل PCR إلى 1 ميكرومتر في 10 ملي مولار تريس ، درجة الحموضة 8.5.

< p class = "jove_title" >4. Amplicon PCR لتضخيم منطقة (مناطق) V مع إرفاق تسلسلات محول البروز

1. قم بإعداد مزيج تفاعل Amplicon PCR كما هو موضح في الجدول 2.
2. ضع ختم لوحة PCR شفاف لاصق على اللوحة وقم بتشغيل Amplicon PCR باستخدام المعلمات الواردة في الجدول 3.
3. (اختياري) قم بتشغيل منتجات Amplicon PCR على هلام الاغاروز أو مقايسة الحمض النووي عالية الحساسية التي تتيح القياس الكمي لحجم الأمبليكون (انظر جدول المواد).
   ملاحظة: حجم الamplicon من هذه الدراسة هو 550 نقطة أساس (الشكل 2 أ).

5. تنظيف PCR باستخدام الخرز المغناطيسي

1. جهاز الطرد المركزي للوحة Amplicon PCR بسرعة عند 1,000 × جم لمدة 1 دقيقة لجمع التكثيف.
   ملاحظه: يمكن استخدام شرائط أنبوب PCR بدلا من ألواح PCR لتقليل التلوث. تخلص من أغطية الأنبوب ولا تعيد استخدامها أبدا.
2. قم بتدوير الخرزات المغناطيسية لتفريقها بالتساوي وإضافة 20 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي إلى كل بئر Amplicon PCR ، ثم قم بسحب الحجم بالكامل لأعلى ولأسفل ببطء 10 مرات.
3. احتضن في RT لمدة 5 دقائق. ضع لوحة PCR على حامل مغناطيسي لمدة دقيقتين حتى يتم جمع الخرز المغناطيسي ويصبح المادة الطافية صافية. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها.
4. اغسل الخرزات ب 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80٪ أثناء وجود لوحة PCR على الحامل المغناطيسي واحتضانها لمدة 30 ثانية عند RT على الحامل المغناطيسي. قم بإزالة المادة الطافية بعناية.
5. كرر الغسيل للمرة الثانية. الآن ، استخدم طرف ماصة ناعم لإزالة أي إيثانول متبقي من الآبار والسماح بتجفيف الهواء لمدة 10 دقائق.
6. قم بإزالة لوحة PCR من الحامل المغناطيسي وأضف 52.5 ميكرولتر من 10 ملي مولار Tris pH 8.5 إلى كل بئر. ماصة لأعلى ولأسفل 10 مرات لتعليق الخرز واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
7. انقل لوحة PCR إلى الحامل المغناطيسي لجمع الخرز المغناطيسي ونقل 50 ميكرولتر من المادة الطافية إلى لوحة PCR نظيفة. ضع ختم لوحة PCR شفافة لاصقة على اللوحة واحفظها على درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.

Amplicon PCR الاشعال أمامي 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGagagtttgatcMtggctcag-3' عكس 5 '- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTGTATAAGAGACAGTTACCGCGGCTGCTGGCAC -3 ' يتم عرض التسلسلات المحددة للموضع بخط غامق وغير غامق هو تسلسل المحول المتدلي.

الجدول 1: Amplicon PCR الاشعال.

إعداد تفاعل Amplicon PCR حجم الحمض النووي الميكروبي (5ng / μl) 2.5 ميكرولتر التمهيدي الأمامي (1 ميكرومتر؛ من الخطوة 3.1) 5.0 ميكرولتر التمهيدي العكسي (1 ميكرومتر؛ من الخطوة 3.1) 5.0 ميكرولتر 2X HotStart الجاهز ميكس 12.5 ميكرولتر مجموع 25.0 ميكرولتر

الجدول 2: Amplicon PCR الاشعال.

Amplicon PCR إعداد 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق 25 دورة من: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية 72 درجة مئوية لمدة 3 دقائق استمر في 4 درجات مئوية

الجدول 3: إعداد برنامج Amplicon PCR.

Results

الشكل 1: ظروف السكن في EE و NE ومجانسات البراز (كما هو موضح في البروتوكول)

الشكل 2: إعداد مكتبة الميكروبيوم 16S.(أ) منتجات أمبليكون تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المنقاة المشتقة من الحمض النووي الجيني للبراز. (ب) رسم لوحة الفهر...

Materials