فئة
1. توليد عضيات CRC المزروعة على مصفوفة اصطناعية خارج الخلية
< p class = "jove_content" > تم توضيح الإجراءات التجريبية للثقافة العضوية CRC ل PDXs القولون في
الشكل 1 ب (الخطوة 4).
- إنشاء وسيط استزراع مناسب لعضويات CRC المشتقة من PDX (انظر جدول المواد ، "وسط الثقافة العضوية CRC") باستخدام الوسائط الموصوفة سابقا لعضويات القولون البشري.
- ضع 150 ميكرولتر من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية (انظر جدول المواد) لكل بئر على صفيحة مكونة من 12 بئرا على الجليد ثم احتضنها لمدة 30-60 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لترسيخ المواد الهلامية.
- قم بتعليق حبيبات الخلية لخلايا CRC التي تم الحصول عليها من نموذج فأر PDX باستخدام وسط الثقافة العضوية CRC (من الخطوة 1.1) مع 5٪ FCS للتكيف مع 3 × 105 خلايا / مل. بعد ذلك ، قم بزرع 1 مل من الوسط على الصفيحة الاصطناعية المطلية بالمصفوفة خارج الخلية المحضرة في الخطوة 1.2 واحتضانها طوال الليل عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. استخدم مقياس كثافة الدم لحساب عدد الخلايا السرطانية ، بما في ذلك الخلايا المفردة والمجموعات متعددة الخلايا (مجموعة من الخلايا الملتصقة) في تعليق الخلية.
ملاحظة: يتم استخدام 5٪ FCS لإخماد النشاط الأنزيمي المتبقي للكولاجيناز في هذه الدراسة.
- اجمع وسط الاستزراع بعناية ، بما في ذلك الخلايا العائمة المنفصلة عن الصفيحة الاصطناعية المطلية بالمصفوفة خارج الخلية ، في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل في اليوم التالي وقم بتشغيله بجهاز طرد مركزي عند 1,400 × جم لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 70 ميكرولتر من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية على الجليد.
- لزيادة صلاحية خلايا CRC ، قم بتراكب المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية المحتوية على الخلايا السرطانية على الخلايا العضوية السرطانية المتصلة بالصفيحة الاصطناعية المطلية بالمصفوفة خارج الخلية واحتضانها لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية ، 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 ترسيخ طلاء المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية. بعد ذلك ، قم باحتضانه ب 1 مل من وسط زراعة الخلايا العضوية CRC مع 1٪ FCS عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
- قم بتغيير وسيط الثقافة كل يومين. نظرا لأن عضيات CRC تملأ الوسط ، فقد يصبح من الضروري تغيير الوسيط يوميا.
فئة
2. توليد وإثراء جزيئات الفيروسات الوعسية GFP
< p class = "jove_content" > الإجراءات التجريبية لتوليد وإثراء جزيئات الفيروسات الغنية ب GFP موضحة في
الشكل 1 ج (الخطوة 5).
- استزراع HEK293T الخلايا باستخدام معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 ، وسط يحتوي على 10٪ FCS وإعداد ستة أطباق مقاس 10 سم (2 × 106 خلايا لكل طبق) لإجراء التعداء التالي.
- من أجل التعداء لكل طبق ، قم بإعداد 500 ميكرولتر من الخليط بما في ذلك 20 ميكرولتر من كاشف التعدي في DMEM مع ناقل PRRL-GFP (5 ميكروغرام) واثنين من البلازميدات العبوية الفيروسية ، مثل pCMV-VSV-G (1 ميكروغرام) و pCMV-dR8.2 dvpr (5 ميكروغرام) ، في أنبوب دقيق معقم سعة 1.5 مل. احتفظي بالخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم ضعيه على كل طبق من الأطباق مقاس 10 سم واحتضنه لمدة 18 ساعة.
- قم بإزالة الوسط ، وأضف 5 مل من الطازج 10٪ FCS-RPMI 1640 المتوسط إلى كل طبق ، واتركه واقفا لمدة 24 ساعة.
- اجمع الوسط المكيف من كل طبق في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتخزين ما مجموعه 30 مل من الوسط عند 4 درجات مئوية طوال الليل. أضف 5 مل من RPMI 1640 الطازج على كل طبق واتركه واقفا لمدة 24 ساعة.
- اجمع الوسط المكيف من كل طبق في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل واحتفظ بإجمالي 30 مل من الوسط على الجليد. ثم تجاهل الخلايا.
- قم بتصفية 60 مل من الوسط (من الخطوات 2.4-2.5) من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة الخلايا وتقسيم هذه الكمية إلى اثني عشر أنبوب طرد مركزي من مادة البولي بروبيلين سعة 5 مل للطرد المركزي الفائق.
- لتركيز الفيروسات ، قم بطردها المركزي باستخدام دوار دلو متأرجح عند 85,327 × جم لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
- قم بإزالة الوسيط على الفور. لحل حبيبات الفيروس المركزة ، ضع 250 ميكرولتر من خليط لحم الخنزير المغذي F-12 (F12) / DMEM بدون FCS في كل من الأنابيب الاثني عشر واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية طوال الليل. لاحظ أن حبيبات الفيروس غالبا ما تكون غير مرئية.
- قم بماصة الوسط برفق لجمع 3 مل من مخزون الفيروسات العدسية المركزة 5x GFP ، في المجموع ، ويفترض أن يشمل جزيئات الفيروسات العدسية GFP مع 108 وحدات تحويل لكل مل (TU / mL). بعد ذلك ، قم بتخزين الأنابيب الدقيقة الاثني عشر سعة 1.5 مل (بما في ذلك 250 ميكرولتر لكل أنبوب) في ظروف معقمة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام. قم بإعداد العديد من الحصص الصغيرة من المحلول الأصلي لتجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة.
فئة
3. وضع العلامات على الخلايا العضوية CRC بجزيئات الفيروسات العدسية GFP المزروعة على مصفوفة اصطناعية خارج الخلية
< p class = "jove_content" > تم توضيح الإجراءات التجريبية لتصنيف الخلايا العضوية CRC بفيروس العدسات GFP في
الشكل 1 ج (الخطوة 6).
- اسمح لعضويات CRC المحضرة في الخطوة 1.6 بالنمو دون تدخل لمدة 7-10 أيام ، وحصدها ميكانيكيا باستخدام مكشطة خلية معقمة ، وانقلها إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
ملاحظه: يعتمد نمو عضيات CRC في الثقافة على طبيعة الأورام الأصلية من المرضى. تجنب فرط نمو عضيات CRC عن طريق الحفاظ عليها عند التقاء 60-70٪ قبل نقلها بنسبة انقسام 1: 2 إلى صفيحة اصطناعية جديدة من 12 بئرا مطلية بمصفوفة خارج الخلية.
قم - بالطرد المركزي للأنبوب الدقيق لمدة 3 دقائق عند 1,400 × جم ، وقم بإزالة وسط الثقافة وحل حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من PBS عن طريق النقر اللطيف.
- الطرد المركزي الأنبوب الدقيق لمدة 3 دقائق عند 1,400 × جم والقضاء على PBS.
- لفصل عضيات CRC الملتصقة ، أضف 500 ميكرولتر من محلول انفصال الخلية من الإنزيمات المحللة للبروتين والكولاجينية إلى حبيبات الخلية في الأنبوب واخلطها عن طريق النقر اللطيف. ثم اترك الأنابيب لتستقر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- قم بعمل ماصة معلق الخلية برفق شديد مع 500 ميكرولتر إضافي من 1٪ FCS-DMEM عدة مرات في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل لفصل الخلايا تقريبا. يقلل توليد الخلايا المفردة من عضيات CRC عن طريق الماصة القاسية من بقاء الخلية بشكل ملحوظ. وبالتالي ، من الضروري ترك كتلة الخلايا قابلة للاكتشاف بصريا في تعليق الخلية عن طريق سحب العينة برفق في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
قم - بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 3 دقائق عند 1,400 × جم وقم بإزالة المادة الطافية.
- قم بحل حبيبات الخلية بمزيج من 100 ميكرولتر من مخزون الفيروسات العدسية GFP 5x (>108 TU / mL) و 400 ميكرولتر من وسط الثقافة العضوية CRC في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل عن طريق النقر اللطيف للتكيف مع تركيز 5 × 105 خلايا سرطانية منفصلة لكل 500 ميكرولتر. استخدم مقياس كثافة الدم لحساب عدد الخلايا السرطانية ، بما في ذلك الخلايا المفردة ومجموعات الخلايا في معلق الخلية ، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 1.3).
- قم بإعداد صفيحة اصطناعية من 12 بئرا مطلية بمصفوفة خارج الخلية ، كما هو موضح في الخطوة 1.2. بعد ذلك ، ضع 500 ميكرولتر من معلق الخلية المحضر في الخطوة 3.7 على اللوحة واتركه لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
- اجمع الوسط مع الخلايا العائمة المنفصلة عن الصفيحة الاصطناعية المطلية بالمصفوفة خارج الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. قم بالطرد المركزي عند 1,400 × جم ثم قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 70 ميكرولتر من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية على الجليد.
- لزيادة قابلية خلايا CRC للبقاء ، قم بتراكب المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية المحتوية على الخلايا السرطانية على عضيات الورم المتصلة بلوحة 12 بئرا المطلية بالمصفوفة الاصطناعية خارج الخلية ، كما هو موضح في الخطوة 1.5. بعد ذلك ، قم باحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لترسيخ طلاء المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية ثم زراعتها ب 1 مل من وسط الثقافة العضوية CRC مع 1٪ FCS عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO2.
- راقب الخلايا بعد ثلاثة أيام من الإصابة تحت المجهر الفلوري لتأكيد إيجابية GFP بنسبة 100٪ تقريبا بسبب استخدام عيار عال من جزيئات الفيروسات العدسية (انظر الشكل 2 أ).
- استزراع عضيات CRC لمدة 7-10 أيام لتوسيع نمو الخلايا قبل الحقن في الفئران المتلقية.
