نماذج فأر ورم خبيث تلقائي: منصة لدراسة الإمكانات النقيلية لخلايا سرطان القولون والمستقيم المحقونة تقويم العظام

الملخص

المصدر: Okazawa, Y., et al. الكشف عالي الحساسية عن النقائل الدقيقة الناتجة عن العضيات المنقولة بفيروس العدسات GFP المزروعة من ورم القولون المشتق من المريض.J. Vis. Exp.(2018).

يصف هذا الفيديو بروتوكول إنشاء نموذج فأر ورم خبيث عفوي للطعوم الغريبة المشتقة من سرطان القولون والمستقيم أو PDXs. تحاكي نماذج الطعم الغريب هذه جزئيا سمات الأورام الخبيثة البشرية وتفهم الجوانب الحرجة للأورام الخبيثة البشرية ، بما في ذلك الغزو والورم الخبيث.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. تشريح CRC PDXs من الفئران

< p class = "jove_content" > تم توضيح الإجراءات التجريبية لتشريح CRC PDXs في الشكل 1 ب (الخطوة 2).

1. اسمح للورم بالنمو تحت الجلد إلى ~ 1 سم³ في الحجم ، والذي يستغرق عادة حوالي 1-3 أشهر.
2. تخدير الفأر باستنشاق الأيزوفلوران باستخدام جهاز التخدير باستنشاق الصغيرة وتطهير الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول.
3. ضع الماوس في وضع الانبطاح على مقعد المختبر. شق الجلد وفضح الورم وفصل الجلد بعناية عن الورم باستخدام مقص معقم. بعد إزالة الورم ، ضعه على طبق بتري مقاس 10 سم ، وقم بإزالة أي مناطق نخرية بشكل كبير من الورم ، ثم اشطفه مرتين باستخدام 5 مل من PBS.
   ملاحظه: غالبا ما تكون المناطق النخرية أكثر بياضا ونعومة وأكثر قابلية للتفتيت من المناطق المحيطة.
4. ضع الورم على الجليد وقسمه بالتساوي إلى 4 أجزاء على الأقل لتطبيقات مختلفة ، بما في ذلك 1) الثقافة العضوية CRC ، 2) الزرع في الفئران الثانوية ، 3) الفحص النسيجي ، و 4) تجميد وتخزين شظايا الورم.
   1. لتوليد عضيات CRC ، ضع أنسجة الورم الصلبة على طبق بتري مقاس 6 سم يحتوي على 1 مل من PBS المعقم. احتفظ بالأنسجة على الثلج حتى المعالجة.
   2. لإنشاء نموذج PDX ل CRC البشري ، قم بتمرير CRC PDXs الجديدة إلى ماوس ثانوي. قم بتقطيع أنسجة الورم إلى قطع صغيرة (5 × 5 × 5 مم³ في الحجم) باستخدام شفرات حلاقة معقمة واغمس شظايا الأنسجة هذه برفق في 50 ميكرولتر من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية. بعد ذلك ، قم بزرع هذه الأجزاء في الأجزاء السفلية من الجيوب تحت الجلد اليمنى واليسرى من فأر NOG.
   3. ضع الفأر المخدر في وضع الانبطاح على مقعد المختبر. قم بعمل شق صغير في الأجزاء السفلية من الجانبين الأيمن والأيسر للفأر المتلقي لتوليد جيوب تحت الجلد لزرع الأنسجة باستخدام مقص معقم. احرص على عدم ثقب الغشاء البريتوني. يجب أن يكون هناك القليل من النزيف مع هذا الإجراء.
   4. اغمس شظايا الورم المعدة أعلاه برفق في 50 ميكرولتر من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية ثم قم بزرعها في الأجزاء السفلية من الجيوب تحت الجلد اليمنى واليسرى.
   5. خياطة الشق بمشابك الجرح في الفئران التي تخضع لعمليات جراحية. تأكد من أن أنسجة الورم المزروعة تقع على مسافة ما من الشق تحت الجلد.
      ملاحظه: وفقا لتقليل الإجراءات الجراحية ، لم يتم إعطاء أي علاجات للألم والعدوى بعد الجراحة في هذه الدراسة.
   6. ضع الماوس على وسادة دافئة وحافظ على وضع الاستلقاء القصي حتى يتم استعادة الوعي الكافي. بمجرد أن تتعافى تماما وتتمكنها من الجلوس على الأرجل الأربعة ، يمكن إعادة الفئران إلى أقفاصها المنزلية. لمنع الافتراس ، لا تسمح بالتكاثر مع غير العاملة في نفس القفص.
   7. للتحليل النسيجي ، قم بتثبيت العينات في 5 مل من الفورمالين المحايد 10٪ في أنبوب مخروطي 15 مل في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين.
   8. للحفظ بالتبريد ، قم بتقطيع أنسجة الورم إلى قطع صغيرة (5 × 5 × 5 مم³ في الحجم) واغمس العينات برفق في 500 ميكرولتر من محلول تجميد الخلايا في أنابيب تبريدية 1-1.5 مل. ثم انقل الأنبوب إلى فريزر -80 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >2. استخراج PDXs في تعليق الخلية للثقافة العضوية CRC

< p class = "jove_content" > تم توضيح الإجراءات التجريبية لتفكيك CRC PDXs في الشكل 1 ب (الخطوة 3).

1. ضع شظايا الورم المحضرة أعلاه (الخطوة 1.4.1) على طبق بتري مقاس 10 سم.
2. قم بفرم الأجزاء باستخدام شفرات حلاقة معقمة وانقلها إلى أنبوب مخروطي الشكل سعة 15 مل يحتوي على 8 مل من مصل عجل الجنين بنسبة 10٪ (FCS) - Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) مع 80 ميكرولتر من مخزون إنزيم الكولاجيناز (انظر جدول المواد).
3. أغلق الأنبوب بإحكام ولف الغطاء بالبارافيلم لمنع التسرب. لفصل شظايا الورم المفروم في معلق الخلية ، حركها برفق لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. لاحظ أنه سيظل هناك العديد من شظايا الأنسجة غير المهضومة المتبقية في الأنبوب.
4. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية. قم بحل حبيبات الخلية باستخدام 10 مل من 10٪ FCS-DMEM لعمل تعليق الخلية.
5. للتخلص من بقايا الأنسجة غير المهضومة ، قم بتصفية معلق الخلية مرتين باستخدام مصفاة الخلية 40 ميكرومتر الموضوعة على أنبوب مخروطي سعة 50 مل. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للتدفق عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية واحتفظ بالحبيبات على الجليد.

< p class = "jove_title" >3. توليد عضيات CRC المستنبتة على مصفوفة اصطناعية خارج الخلية

< p class = "jove_content" > تم توضيح الإجراءات التجريبية للثقافة العضوية CRC ل PDXs القولون في الشكل 1 ب (الخطوة 4).

1. إنشاء وسيط استزراع مناسب لعضويات CRC المشتقة من PDX (انظر جدول المواد ، "وسط الثقافة العضوية CRC") باستخدام الوسائط الموصوفة سابقا لعضويات القولون البشري.
2. ضع 150 ميكرولتر من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية (انظر جدول المواد) لكل بئر على صفيحة مكونة من 12 بئرا على الجليد ثم احتضنها لمدة 30-60 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لترسيخ المواد الهلامية.
3. قم بتعليق حبيبات الخلية من الخطوة 2.5 باستخدام وسط الثقافة العضوية CRC (من الخطوة 3.1) مع 5٪ FCS لتحقيق التعديل إلى 3 × 10⁵ خلايا / مل. ثم ، قم بزرع 1 مل من الوسط على صفيحة مصفوفة اصطناعية خارج الخلية محضرة في الخطوة 3.2. وتحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. استخدم مقياس كثافة الدم لحساب عدد الخلايا السرطانية ، بما في ذلك الخلايا المفردة والمجموعات متعددة الخلايا (مجموعة من الخلايا الملتصقة) في تعليق الخلية.
   ملاحظة: يتم استخدام 5٪ FCS لإخماد النشاط الأنزيمي المتبقي للكولاجيناز في هذه الدراسة.
4. اجمع وسط الاستزراع بعناية ، بما في ذلك الخلايا العائمة المنفصلة عن الصفيحة الاصطناعية المطلية بالمصفوفة خارج الخلية ، في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل في اليوم التالي وقم بتشغيله بجهاز طرد مركزي عند 1,400 × جم لمدة 5 دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 70 ميكرولتر من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية على الجليد.
5. لزيادة صلاحية خلايا CRC ، قم بتراكب المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية المحتوية على الخلايا السرطانية على الخلايا العضوية السرطانية المتصلة بالصفيحة الاصطناعية المطلية بالمصفوفة خارج الخلية واحتضانها لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية ، 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ ترسيخ طلاء المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية. بعد ذلك ، قم باحتضانه ب 1 مل من وسط زراعة الخلايا العضوية CRC مع 1٪ FCS عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2.}
6. قم بتغيير وسيط الثقافة كل يومين. نظرا لأن عضيات CRC تملأ الوسط ، فقد يصبح من الضروري تغيير الوسيط يوميا.

< p class = "jove_title" >4. توليد وإثراء جزيئات GFP Lentiviral

< p class = "jove_content" > الإجراءات التجريبية لتوليد وإثراء جزيئات الفيروسات الغنية ب GFP موضحة في الشكل 1 ج (الخطوة 5).

1. استزراع HEK293T الخلايا باستخدام معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 ، وسط يحتوي على 10٪ FCS وإعداد ستة أطباق مقاس 10 سم (2 × 10⁶ خلايا لكل طبق) لإجراء التعداء التالي.
2. من أجل التعداء لكل طبق ، قم بإعداد 500 ميكرولتر من الخليط بما في ذلك 20 ميكرولتر من كاشف التعدي في DMEM مع ناقل PRRL-GFP (5 ميكروغرام) ¹² واثنين من البلازميدات العبوية الفيروسية ، مثل pCMV-VSV-G (1 ميكروغرام) و pCMV-dR8.2 dvpr (5 ميكروغرام) ، في أنبوب دقيق معقم 1.5 مل. احتفظي بالخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة ثم ضعيه على كل طبق من الأطباق مقاس 10 سم واحتضنه لمدة 18 ساعة.
3. قم بإزالة الوسط ، وأضف 5 مل من الطازج 10٪ FCS-RPMI 1640 المتوسط إلى كل طبق ، واتركه واقفا لمدة 24 ساعة.
4. اجمع الوسط المكيف من كل طبق في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بتخزين ما مجموعه 30 مل من الوسط عند 4 درجات مئوية طوال الليل. أضف 5 مل من RPMI 1640 الطازج على كل طبق واتركه واقفا لمدة 24 ساعة.
5. اجمع الوسط المكيف من كل طبق في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل واحتفظ بإجمالي 30 مل من الوسط على الجليد. ثم تجاهل الخلايا.
6. قم بتصفية 60 مل من الوسط (من الخطوات 4.4-4.5) من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة الخلايا وتقسيم هذه الكمية إلى اثني عشر أنبوبا للطرد المركزي من مادة البولي بروبلين سعة 5 مل للطرد المركزي الفائق.
7. لتركيز الفيروسات ، قم بطردها المركزي باستخدام دوار دلو متأرجح (انظر جدول المواد) عند 85،327 × جم لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية.
8. قم بإزالة الوسيط على الفور. لحل حبيبات الفيروس المركزة ، ضع 250 ميكرولتر من خليط لحم الخنزير المغذي F-12 (F12) / DMEM بدون FCS في كل من الأنابيب الاثني عشر واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية طوال الليل. لاحظ أن حبيبات الفيروس غالبا ما تكون غير مرئية.
9. قم بماصة الوسط برفق لجمع 3 مل من مخزون الفيروسات العدسية المركزة 5x GFP ، في المجموع ، ويفترض أن يشمل جزيئات الفيروسات العدسية GFP مع 10⁸ وحدات تحويل لكل مل (TU / mL). بعد ذلك ، قم بتخزين الأنابيب الدقيقة الاثني عشر سعة 1.5 مل (بما في ذلك 250 ميكرولتر لكل أنبوب) في ظروف معقمة عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى عام. قم بإعداد العديد من الحصص الصغيرة من المحلول الأصلي لتجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة.

فئة

5. وضع العلامات على الخلايا العضوية CRC بجزيئات الفيروسات العدسية GFP المزروعة على مصفوفة اصطناعية خارج الخلية

< p class = "jove_content" > تم توضيح الإجراءات التجريبية لتصنيف الخلايا العضوية CRC بفيروس العدسات GFP في الشكل 1 ج (الخطوة 6).

1. اسمح للعضيات CRC المحضرة في الخطوة 3.6 بالنمو دون تدخل لمدة 7-10 أيام ، وحصادها ميكانيكيا باستخدام مكشطة خلية معقمة ، ثم انقلها إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
   ملاحظه: يعتمد نمو عضيات CRC في الثقافة على طبيعة الأورام الأصلية من المرضى. تجنب فرط نمو عضيات CRC عن طريق الحفاظ عليها عند التقاء 60-70٪ قبل نقلها بنسبة انقسام 1: 2 إلى صفيحة اصطناعية جديدة من 12 بئرا مطلية بمصفوفة خارج الخلية.
قم
2. بالطرد المركزي للأنبوب الدقيق لمدة 3 دقائق عند 1,400 × جم ، وقم بإزالة وسط الثقافة وحل حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من PBS عن طريق النقر اللطيف.
3. الطرد المركزي الأنبوب الدقيق لمدة 3 دقائق عند 1,400 × جم والقضاء على PBS.
4. لفصل عضيات CRC الملتصقة ، أضف 500 ميكرولتر من محلول انفصال الخلية من الإنزيمات المحللة للبروتين والكولاجينية إلى حبيبات الخلية في الأنبوب واخلطها عن طريق النقر اللطيف. ثم اترك الأنابيب لتستقر لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. قم بعمل ماصة معلق الخلية برفق شديد مع 500 ميكرولتر إضافي من 1٪ FCS-DMEM عدة مرات في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل لفصل الخلايا تقريبا. يقلل توليد الخلايا المفردة من عضيات CRC عن طريق الماصة القاسية من بقاء الخلية بشكل ملحوظ. وبالتالي ، من الضروري ترك كتلة الخلايا قابلة للاكتشاف بصريا في تعليق الخلية عن طريق سحب العينة برفق في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
قم
6. بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 3 دقائق عند 1,400 × جم وقم بإزالة المادة الطافية.
7. قم بحل حبيبات الخلية بمزيج من 100 ميكرولتر من مخزون فيروس العدسات GFP 5x (>10⁸ TU / mL) و 400 ميكرولتر من وسط الثقافة العضوية CRC في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل عن طريق النقر اللطيف للتكيف مع تركيز 5 × 10⁵ خلايا سرطانية منفصلة لكل 500 ميكرولتر. استخدم مقياس الدم لحساب عدد الخلايا السرطانية ، بما في ذلك الخلايا المفردة ومجموعات الخلايا في معلق الخلية ، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 3.3).
8. قم بإعداد صفيحة اصطناعية من 12 بئرا مطلية بمصفوفة خارج الخلية ، كما هو موضح في الخطوة 3.2. بعد ذلك ، ضع 500 ميكرولتر من معلق الخلية المحضر في الخطوة 5.7 على اللوحة واتركه لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
9. اجمع الوسط مع الخلايا العائمة المنفصلة عن الصفيحة الاصطناعية المطلية بالمصفوفة خارج الخلية في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل. قم بالطرد المركزي عند 1,400 × جم ثم قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 70 ميكرولتر من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية على الجليد.
10. لزيادة قابلية خلايا CRC للبقاء ، قم بتراكب المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية المحتوية على الخلايا السرطانية على عضيات الورم المتصلة بلوحة 12 بئرا المطلية بالمصفوفة الاصطناعية خارج الخلية ، كما هو موضح في الخطوة 3.5. بعد ذلك ، قم باحتضان اللوحة لمدة 30 دقيقة في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لترسيخ طلاء المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية ثم زراعتها ب 1 مل من وسط الثقافة العضوية CRC مع 1٪ FCS عند 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO₂.
11. راقب الخلايا بعد 3 أيام من الإصابة تحت المجهر الفلوري لتأكيد إيجابية GFP بنسبة 100٪ تقريبا بسبب استخدام عيار عال من جزيئات الفيروسات العدسية (انظر الشكل 2 أ).
12. استزراع عضيات CRC لمدة 7-10 أيام لتوسيع نمو الخلايا قبل الحقن في الفئران المتلقية.

فئة

6. توليد النقائل بواسطة عضيات CRC المسماة GFP في الفئران المتلقية

الإجراءات التجريبية لتوليد النقائل باستخدام عضيات CRC المسماة GFP موضحة في الشكل 1 ج (الخطوة 7).

1. لفصل عضيات CRC المسماة GFP في معلق الخلية ، قم بحصادها ميكانيكيا باستخدام مكشطة خلية معقمة ونقلها إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل ، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 5.1).
قم
2. بالطرد المركزي للأنبوب الدقيق لمدة 3 دقائق عند 1,400 × جم ، وقم بإزالة وسط الثقافة ، وقم بحل حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من PBS عن طريق النقر اللطيف.
3. الطرد المركزي الأنبوب الدقيق لمدة 3 دقائق عند 1,400 × جم والقضاء على PBS.
4. قم بتراكب 500 ميكرولتر من محلول انفصال الخلية على حبيبات الخلية في الأنبوب واخلطها عن طريق النقر اللطيف. بعد ذلك ، اترك الخليط واقفا لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل عضيات CRC الملتصقة إنزيميا ، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 5.4).
قم
5. بتقطيع معلق الخلية برفق شديد مع 500 ميكرولتر إضافي من 1٪ FCS-DMEM عدة مرات في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل لفصل الخلايا تقريبا، كما هو موضح أعلاه (الخطوة 5.5). يقلل توليد الخلايا المفردة من عضيات CRC عن طريق الماصة القاسية من بقاء الخلية بشكل ملحوظ. وبالتالي ، اترك كتلة الخلايا قابلة للاكتشاف بصريا في تعليق الخلية عن طريق سحب العينة برفق في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
قم
6. بالطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 3 دقائق عند 1,400 × جم وقم بإزالة المادة الطافية.
7. لإنشاء نموذج فأر ورم خبيث تلقائي ل CRC PDXs:
   1. قم بإعداد معلق خلوي يتضمن 5 × 10⁵ خلايا في 50 ميكرولتر من PBS مع 50٪ مصفوفة اصطناعية خارج الخلية لكل فأر. حافظ على التعليق على الثلج قبل الاستخدام. استخدم مقياس كثافة الدم لحساب الخلايا السرطانية ، كما هو موضح في الخطوة 3.3.
   2. تخدير الفأر باستنشاق الأيزوفلوران باستخدام جهاز تخدير استنشاق الصغيرة وتطهير الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول. تأكد من المعدل الطبيعي وعمق التنفس وعدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم للتخدير المناسب. مرهم بيطري على العينين هو خيار لمنع جفاف العين أثناء التخدير.
   3. ضع فأر NOG في وضع ضعيف على مقعد المختبر. أمسك الغشاء المخاطي للمستقيم بملاقط معقمة واسحبه برفق من فتحة الشرج. بعد ذلك ، قم على الفور بحقن تعليق الخلية المحضر في الخطوة 6.7.1 في تحت الغشاء المخاطي للمستقيم للفأر باستخدام حقنة (حجم الإبرة: 22 جم). بشكل روتيني ، يتم استخدام 4-6 فئران لكل مجموعة لتقييم النتائج.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتوليد النقائل بواسطة عضيات CRC المشتقة من PDX المسماة بفيروس العدسات GFP في فئران NOG.(أ) زرع قطع صغيرة من أنسجة سرطان الخلايا القلبية تحت الجلد في فئران NOG (الخطوة 1). تم تقطيع أنسجة CRC التي تم تشريحها جراحيا من المريض إلى قطع وزرعها تحت الجلد في فئران NOG. s.c.: زرع تحت الجلد. (ب) توليد عضيات CRC منفصلة عن PDXs (ا...

المواد