إنشاء نموذج فأر النقائل التجريبية: زرع GFP الذي يعبر عن الخلايا العضوية CRC في نموذج PDX للكشف عن النقائل الدقيقة

الملخص

المصدر: أوكازاوا، Y. et al. الكشف عالي الحساسية عن النقائل الدقيقة الناتجة عن العضيات المنقولة بفيروس العدسات GFP المزروعة من ورم القولون المشتق من المريض. J. Vis. إكسب. (2018).

يصف هذا الفيديو بروتوكول توليد النقائل بواسطة عضيات CRC المشتقة من PDX المسماة بفيروس العدسات GFP في طحال الفأر الذي يعاني من نقص المناعة. يمكن الكشف عن النقائل الدقيقة السرطانية التي تستعمر أعضاء أخرى باستخدام المجهر الفلوري لتقييم تعبير GFP.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. توليد النقائل بواسطة عضيات CRC المسماة GFP في الفئران المتلقية

1. لإنشاء نموذج ورم خبيث تجريبي ل CRC PDXs:
   1. قم بإعداد معلق الخلايا العضوية CRC بما في ذلك 4 × 10⁴ خلايا في 50 ميكرولتر من PBS لكل فأر. حافظ على التعليق على الثلج قبل الاستخدام. استخدم مقياس كثافة الدم لحساب الخلايا السرطانية. (احسب عدد الخلايا السرطانية بما في ذلك الخلايا المفردة والمجموعات متعددة الخلايا في تعليق الخلية).
   2. تخدير الفأر باستنشاق الأيزوفلوران باستخدام جهاز تخدير استنشاق الصغيرة وتطهير الجلد بنسبة 70٪ من الإيثانول. تأكد من المعدل الطبيعي وعمق التنفس وعدم وجود منعكس قرصة إصبع القدم للتخدير المناسب. مرهم بيطري على العينين هو خيار لمنع جفاف العين أثناء التخدير.
   3. ضع فأر NOG المخدر في وضع الانبطاح على مقعد المختبر. قم بعمل شق صغير في الجزء السفلي من الجناح الأيسر ثم قم بقص الصفاق لكشف الطحال بعناية باستخدام مقص وملاقط معقمة. أمسك الأنسجة الدهنية المرتبطة بالطحال بملاقط معقمة ، ثم قم بحقن 50 ميكرولتر ببطء من تعليق الخلية (المحضر على النحو الوارد أعلاه ، الخطوة 1.1) في الطحال. تأكد من حقن معلق الخلية بشكل مناسب دون تسرب خارجي من الطحال. بشكل روتيني ، يتم استخدام 4 فئران لكل مجموعة لتقييم النتائج.
2. ضع جميع الفئران على وسادة دافئة بعد الجراحة وحافظ عليها في وضع الاستلقاء القصي حتى يتم استعادة الوعي الكافي. بمجرد أن تتعافى الفئران تماما وتكون قادرة على الجلوس على جميع الأرجل الأربعة ، أعيدها إلى أقفاص منزلها. لمنع الافتراس ، لا تسمح بالتكاثر مع غير العاملة في نفس القفص.
3. تحقق من تسرب الخيط وتأكد من أن الفئران على قيد الحياة ، في المجموعة التي تم علاجها جراحيا ، في اليوم التالي. افحص الفئران بحثا عن علامات المرض وقم بقياس أحجام الورم ، باستخدام الفرجار ، في جميع الفئران مرة واحدة في الأسبوع.
4. راقب الفئران للكشف عن ورم خبيث تلقائي (لفترات تصل إلى 2.5 شهر) والورم الخبيث التجريبي (شهر واحد) بعد الحقن.
5. التضحية بالفئران عن طريق التخدير وخلع عنق الرحم في الأيام المحددة. تشريح الأورام الأولية والأنسجة المختلفة بما في ذلك الكبد والرئتين. ضع الأورام والأعضاء التي تم تشريحها في 5 مل من PBS المثلج على طبق بتري مقاس 10 سم وقم بتخزينها على الثلج.
6. للكشف عن الخلايا العضوية CRC الإيجابية ل GFP ، راقب الأنسجة المقطوعة تحت المجهر الفلوري المجسم. احصل على صور باستخدام كاميرا CCD واستعد باستخدام برنامج معالجة الصور القياسي

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات NOD / Shi-scid IL2Rγ الفئران الفارغة (NOG) المعهد المركزي لحيوانات التجارب ، كاناغاوا ، اليابان قم بتربية ذكور الفئران البالغة من العمر 6 أسابيع في ظل ظروف خالية من الجراثيم وخالية من مسببات الأمراض مقاطع الجرح 2×10 مم تصنيع ناتسومي ، اليابان #C-21-ث الأوتوكلاف قبل الاستخدام حجم إبرة حقنة هاميلتون: مقياس 22 طوكيو ساينس، اليابان تطهير بالكحول بنسبة 70٪ و PBS المعقم. أنبوب مخروطي 50 مل سوميتومو باكليت MS-57500 ميكروتيوب إيبندورف #0030120086 الأوتوكلاف قبل الاستخدام مقياس الدم إرما # 03-202-1 وسط الاستزراع العضوي CRC مع 1٪ أو 5٪ FCS DMEM / F-12 مع مكمل GlutaMAX™ (Gibco # 10565018) مكمل ب 1٪ أو 5٪ FCS ، و 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين ، و 2 نانوغرام / مل hEGF و 10 ميكرومتر Y27632 ، مثبط ROCK. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية. يستخدم في غضون شهر واحد. أ مجهر تيريو فلوري Zeiss Axioplan 2 زييس