عدوى الغدة الغدية المقطعية: تقنية لتوليد سرطان القولون والمستقيم المعزول باستخدام نماذج الفئران المعدلة وراثيا

الملخص

المصدر: Betzler ، A. M. ، et al. نموذج فأر معدل وراثيا لسرطان القولون والمستقيم المتقطع.J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو إنشاء نموذج فأر القولون والمستقيم عن طريق عدوى الغدة الغدية المقطعية. يؤدي جزء القولون المصاب إلى تكوين الأورام داخل هذا الجزء من الغشاء المخاطي ، مما يؤدي إلى تطور الأورام الغدية في النهاية إلى سرطان غازي ونقيلي. هذا النموذج هو منصة جذابة لدراسات بيولوجيا السرطان والتجارب العلاجية قبل السريرية.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحريض الورم الموضعي عن طريق العدوى الجراحية الغدية

1. تحضير للجراحة
   ملاحظه: تقريبا يمكن إحداث أي طفرة شرطية ("floxed") عبر الطريقة الموضحة هنا. يوصى باستخدام الطفرات في الجينات ذات الصلة بسرطان القولون والمستقيم ، مثل APC أو Kras أو Tp53. تعتمد كفاءة إعادة تركيب Cre على حجم البناء المراد استئصاله يتم استئصال التسلسلات الكبيرة ذات الفلكس بشكل أقل كفاءة. يجب تأكيد إعادة تركيب جميع الأليلات في الأورام بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
   1. لتطوير أورام القولون والمستقيم ، استخدم صليبا من الأليلات الشرطية التالية لنموذج أساسي ل CRC (رقم قاعدة بيانات MGI بين قوسين):
      APC^tm2Rak (MGI: 3688435)
      Kras^tm4Tyj (MGI: 2429948)
      Tp53^tm2Tyj (MGI: 3039263)
   2. إذا كان أليل مراسل التألق مطلوبا (على سبيل المثال ، للكشف عن النقائل الدقيقة) ، فاستخدم الأليل التالي:
      GT (ROSA) 26Sor^{tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze} (MGI: 3809522)
      ملاحظه: تتوفر جميع السلالات المذكورة أعلاه عبر مستودع الماوس NCI أو مختبر جاكسون. لا يلزم الصيام حيث يمكن التخلص من جميع البراز المتبقي قبل العدوى الفيروسية الغدية. يؤدي الصيام قبل الجراحة إلى ارتفاع معدل الوفيات في الفترة المحيطة بالجراحة ويشكل ضغطا هائلا على القوارض الصغيرة.
   3. استخدم سيفوفلوران عند 3 - 3.5 فول ٪ للتخدير العام. يشير فقدان منعكس قرصة إصبع القدم إلى تخدير كاف.
   4. قبل الشق الأول، يتم حقن 0.05 ملغم/كغ من البوبرينورفين تحت الجلد.
   5. قم بتغطية عيون الفأر المخدر بمرهم للعين لتجنب جفاف القرنية.
   6. ضع الماوس في وضع ضعيف على طاولة صغيرة. استخدم أشرطة لاصقة غير مؤلمة لكبح جماح الماوس.
   7. احلق البطن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية (يمكن استخدام كريم إزالة الشعر بدلا من ذلك) وقم بتطهير بمسحات الكحول أو اليود. استخدم وقت الاتصال الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
   8. قم بتغطية المجال الجراحي بالستائر المعقمة.
      ملاحظه: استخدام المضادات الحيوية في الفترة المحيطة بالجراحة اختياري ويخضع للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
   9. استخدم أدوات معقمة تستخدم مرة واحدة أو معقمة لجميع العمليات الجراحية.
2. شق البطن في خط الوسط والتعرض للقولون
   1. استخدم المقص (يمكن استخدام المشارط بدلا من ذلك) لعمل شق خط الوسط (~ 15 مم) على جلد أسفل البطن.
   2. التقط عضلات جدار البطن بالملقط وشقها بعناية بالمقص ، وافتح تجويف البطن.
   3. حدد القولون البعيد ، ولمسه فقط بالملقط غير الرضحي. قم بتثبيت القولون بمشبك دقيق (على سبيل المثال ، مشبك الأوعية الدموية Micro Serrefine) على بعد حوالي 15 مم بالقرب من فتحة الشرج.
      ملاحظه: إيلاء اهتمام خاص لضعف القولون في جميع الأوقات. يؤدي الانثقاب حتما إلى التهاب الصفاق والإنتان ويتطلب القتل الرحيم للحيوان.
3. عدوى القولون المقطعية بفيروس الغدي
   1. أدخل أنبوب تفلون مرن عبر الشرج وقم بتقديمه بعناية حتى يصل إلى انسداد التجويف الذي حققه المشبك الذي تم وضعه مسبقا على بعد 15 مم من حافة الشرج. لا تستخدم القوة المفرطة لأن ذلك قد يؤدي إلى ثقب.
   2. قم بتدوير الأنبوب بقنية 30G ، وقم بتوصيل حقنة قياسية سعة 1 مل ، واغسل القولون بمحلول ملحي عادي لإخلاء البراز المتبقي. قد يتطلب ذلك عدة مل من المحلول الملحي.
   3. بمجرد إفراغ القولون البعيد ، قم بإزالة الأنبوب واستبدله بأنبوب تفلون جديد ووضعه مرة أخرى بعيدا مباشرة عن المشبك كما هو موضح أعلاه.
   انسداد
   4. القولون بمشبك ثان ~ 3 مم بعيدا عن المشبك القريب (أي فوق الأنبوب الذي تم إدخاله ، ~ 12 مم من حافة الشرج) ، مما يؤدي إلى إصابة جزء معزول 3 مم.
      ملاحظه: بالنسبة للانسداد البعيد للجزء ، أثبتت مشابك الشريان التاجي Fogarty أنها الأنسب لأنها مطاطية ، مما يؤدي إلى انسداد محكم للقولون على الرغم من الأنبوب داخل اللمعة بين فروع المشبك.
   5. استخدم حقنة ثانية (قياسية 1 مل مع قنية 30 جرام) لحقن 50 - 80 ميكرولتر من 0.25٪ Trypsin-EDTA بعناية في جزء القولون المثبت واحتضانه لمدة 10 دقائق. اترك القنية والحقنة متصلة بأنبوب التفلون لمنع السائل من التسرب مرة أخرى.
      ملاحظه: يجب نفخ القولون لتفتيت الحاجز المخاطي والوصول إلى الخلايا الجذعية للسرداب ، ولكن ليس منتفخا جدا لتجنب ثقب الجزء المثبت.
   6. أولا ، قم بإزالة المشبك البعيد ثم أنبوب التربسين.
   7. اغسل القولون البعيد ب ~ 500 ميكرولتر من محلول ملحي عادي لإزالة التربسين المتبقي.
   8. أدخل أنبوب تفلون جديدا ، وأعد المشبك البعيد إلى مكانه ، وقم بتضخيم جزء القولون ب 50-80 ميكرولتر من محلول الفيروسات الغدية (10¹¹ وحدة تشكيل البلاك (PFU) / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات) واحتضانه لمدة 30 دقيقة (الشكل 2 أ).
      ملاحظه: لا تسكب المحلول الفيروسي لأن ملامسة الغدة قد يؤدي إلى تطور الورم في أي نسيج من أنسجة الفئران المتحولة المشروطة.
   9. قم بإزالة المشابك والأنبوب.
4. إغلاق البطن والتعافي بعد الجراحة
   1. أغلق جدار البطن ب 6-0 خيوط تشغيل سريعة الامتصاص (على سبيل المثال ، بولي ديوكسانون (PDS)).
   2. أغلق الجلد بمشابك الجرح الجراحية.
   3. ضع الماوس على وسادة تسخين مضبوطة على 38 درجة مئوية حتى يتعافى تماما من التخدير.
   4. قم بتطبيق بلعة أخرى بمقدار 0.05 ملغم/كغ من البوبرينورفين بعد 12 ساعة من الجراحة، متبوعة بجرعات بوبرينورفين إضافية كل 12 ساعة إذا لزم الأمر.
   5. راقب الفئران مرة واحدة على الأقل يوميا بحثا عن علامات الضيق بسبب نمو الورم.

2. تنظير القولون

ملاحظة: اعتمادا على الطفرات الشرطية المستخدمة ، تؤدي العدوى الفيروسية الغدية إلى أورام مرئية بالمنظار في غضون 2-4 أسابيع. لذلك ، قم بإجراء أول تنظير للقولون بعد الجراحة بعد أسبوعين من التحريض الفيروسي الغدي وكرر كل أسبوعين. يوصى بنظام متاح تجاريا لتنظير القولون في الفئران.

1. تحضير لتنظير القولون
   ملاحظه: لا يلزم الصيام. عادة ما تكون البراز المتبقية جيدة في القولون البعيد ويمكن دفعها إلى ما وراء الورم أثناء تنظير القولون ، مما يجعل العملية المجهدة للصيام المتكرر غير ضرورية.
   1. استخدم سيفوفلوران عند 3 - 3.5 فول ٪ للتخدير العام. يشير فقدان منعكس قرصة إصبع القدم إلى تخدير كاف.
   2. قم بتغطية عيون الفئران المخدرة بمرهم العين لتجنب جفاف القرنية.
   3. كبح جماح الفئران في وضع ضعيف على طاولة صغيرة.
2. تنظير القولون
   1. أدخل المنظار (قطره 1.9 مم ؛ الطول 10 سم) في الأمعاء من خلال فتحة الشرج وقم بنفخ الهواء بعناية تحت التحكم البصري لتوسيع القولون. لا تقم بنفخ هواء أكثر من المطلوب للفحص.
      ملاحظه: لنفخ الهواء ، يمكن استخدام مضخة الهواء المضادة للضباب لنظام تنظير القولون. في حالة عدم توفر مضخة هواء مضادة للضباب ، يمكن استخدام أي مضخة هواء أخرى ذات إعدادات ضغط منخفض جدا أو هواء مضغوط بصمام دقيق لتقليل الضغط. يؤدي ثاني أكسيد الكربون (CO₂) بسهولة إلى الحماض في القوارض الصغيرة وبالتالي يجب تجنبه.
   2. ادفع المنظار بعناية للأمام حتى يمكن تحديد آفة مخاطية في القولون البعيد (الشكل 1 أ - 1 د).
   3. احفظ الصور بالمنظار للتقييم اللاحق. تم وصف نظام التسجيل بالمنظار للأورام داخل اللمعة من قبل.
   4. قم بإزالة المنظار بحذر وضع الماوس على وسادة تسخين مضبوطة على 38 درجة مئوية حتى يتعافى تماما من التخدير.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. صور بالمنظار القولون لأورام القولون والمستقيم (الأليلات الشرطية للحيوان المعطى بين قوسين).< / > أ. القولون البعيد الطبيعي. ب. الورم الحميد المبكر بعد أسبوعين من عدوى الغد. لاحظ اللون الأخضر بسبب أليل مراسل GFP في هذا الماوس. (APC^tm2Rak ، Kras^tm4Tyj ، GT (ROSA) 26Sor^{tm6 (CAG-ZsGreen1) Hze}).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco لايف تكنولوجيز جي إم بي إتش 14190169 التربسين EDTA (0.25٪ ، فينول ريد) لايف تكنولوجيز جي إم بي إتش 25200072 محلول ملحي عادي 0.9٪ (E154) Serumwerk Bernburg AG 10013 أكوا ad injectabilia ب. براون ميلسونجن إيه جي 235144 Ad5CMV-Cre (الفيروس الغدي ، ج = 2E +11 PFU / مل) ناقل نقل الجينات الأساسي جامعة أيوا 15 مل ، 50 مل أنابيب الطرد المركزي Greiner Bio-One GmbH 188271/227270 أنابيب Eppendorf 1.5 مل / 2 مل Sarstedt AG & Co. 72,695,400 طبق بتري PS 100/15 مم (معقم ، نوكلون) فيشر ساينتفيك جي إم بي إتش 10508921 / NUNC150350 حقنة 1 مل (بدون حجم ميت) - Injekt-F SOLO براون / نيولاب 194291661 إبرة حقن 30G بيكتون ديكنسون 304000 سيفوفلوران (Sevoflurane AbbVie) AbbVie Germany GmbH & Co. KG الأكسجين الطبي اير ليكويدي ميديكال جي إم بي إتش بوبرينورفين (Temgesic) Indivior Eu Ltd. بيبانثين - مرهم للعيون باير فيتال جي إم بي إتش 10047757 آلة التخدير البحثية على الطاولة x / O2 Flush w / Sevoflurane Vaporizer باركلاند العلمية V3000PS / PK مسحات السليلوز لومان وراوشر دويتشلاند 13356 [1] حقنة الأنسولين EMG 1 مل (مع قنية 30 جرام) ب. براون ميلسونجن إيه جي 9161627 ث أنابيب التجويف الدقيقة (التجويف: 0.28 مم / القطر: 0.61 مم) سميث الطبية الألمانية 8 800/100/100 ملقط مايكرو أدسون أدوات العلوم الدقيقة 11018-12 مقص القزحية - ToughCut أدوات العلوم الدقيقة 14058-11 حامل إبرة Olsen-Hegar أدوات العلوم الدقيقة 12002-12 طقم القصاصة التلقائية أدوات العلوم الدقيقة 12020-00 PDS Z1012H 6/0 C1 (خياطة جراحية) جونسون آند جونسون ميديكال جي إم بي إتش Z1012H منحني مايكرو Serrefine الأوعية الدموية المشبك أدوات العلوم الدقيقة 18055-05 فوغارتي سبرينج كليبس ادواردز CDSAFE 6 لوحة ساخنة 062 لابوتكت 13854 إيزيس - ماكينة حلاقة الشعر أسكولاب - براون نافورة الضوء البارد زينون 175 كارل شتورتس 20132101-1 كارل شتورتس نظام كولوفيو ماينز كابل ضوء الألياف البصرية كارل شتورتس 69495NL كارل شتورتس نظام كولوفيو ماينز رأس كاميرا ثلاثي الشرائح TRICAM كارل شتورتس 20221030 كارل شتورتس نظام كولوفيو ماينز وحدة التحكم في الكاميرا TRICAM SLII كارل شتورتس 20223011-1 كارل شتورتس نظام كولوفيو ماينز شاشة مسطحة مقاس 15 بوصة EndoVue كارل شتورتس 9415NN كارل شتورتس نظام كولوفيو ماينز HOPKINS تلسكوب مستقيم إلى الأمام قطر 1.9 مم ؛ طول 10 سم نقل ضوء الألياف البصرية القابل للتعقيم مدمج كارل شتورتس 64301 أ غمد الحماية والفحص كارل شتورتس 61029ج