فحص ربط الأنابيب الدقيقة في خلايا CRC: طريقة لفحص بروتين تاو المرتبط بالأنابيب الدقيقة في خلايا سرطان القولون والمستقيم

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Huda ، M. N. ، et al. فحص للفسفرة وربط الأنابيب الدقيقة جنبا إلى جنب مع توطين بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو مقايسة ربط الأنابيب الدقيقة المستخدمة لفصل بروتين تاو المرتبط بالأنابيب الدقيقة عن كسور بروتين تاو فرط الفسفرة غير الملزمة في خلايا سرطان القولون والمستقيم. يساعد هذا الاختبار في تحديد تأثير المواد الكيميائية المختلفة التي يمكن أن تغير حالة الفسفرة لبروتين تاو ، مما يؤثر على ارتباط الأنابيب الدقيقة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. فحص ربط الأنابيب الدقيقة

1. بالنسبة لمقايسة ربط الأنابيب الدقيقة ، أضف ~ 1 × 10⁶ خلايا HCT 116 إلى أطباق زراعة الأنسجة مقاس 100 مم التي تحتوي على الحد الأدنى من الوسائط الأساسية (MEM) المكملة بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين. بعد يوم واحد من الزراعة ، ستصل الخلايا إلى التقاء 60-70٪.
2. قم بإعداد 1X (2 مل) مخزن مؤقت PEM من 10X PEM مخزن مؤقت عند 4 درجات مئوية عن طريق إضافة 20 ميكرومتر (40 ميكرولتر) باكليتاكسيل و 1 ملي مولار (20 ميكرولتر) GTP. خذ مخزون الأنابيب الدقيقة (MT) من الفريزر -80 درجة مئوية ومخزون العمل بكتريا قولونية تاو من فريزر -20 درجة مئوية.
3. قم بإعداد العينات حسب الجدول 1.
4. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. جهاز طرد مركزي فائق عند 25 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة عند 100,000 × جم.
5. انقل 120 ميكرولتر من المواد الطافية التي تحتوي على تاو غير المرتبط ، لتنظيف الأنابيب ووضع العلامات عليها.
6. أضف 120 ميكرولتر (نفس حجم المادة الطافية) من المخزن المؤقت للعينة 5X إلى الحبيبات التي تحتوي على تاو مرتبط واخلطها جيدا. انقل المحلول لتنظيف الأنابيب الملصقة واخلطها جيدا.
7. قم بقياس تركيز البروتين بواسطة اختبار برادفورد باستخدام مجموعات فحص البروتين التجارية.
   ملاحظه: أثناء تحضير العينات ، استخدم حجم المحلول (الخطوة 1.6) لتحضير كل من عينات الحبيبات والطاف.
8. قم بإعداد عينات من تركيز البروتين المكافئ وأضف 4x SDS محضر حديثا يحتوي على DTT (400 ملليمتر).
   ملاحظه: يمكن تخزين العينات عند -20 درجة مئوية في هذه المرحلة.
9. احتضان العينات على كتلة حرارية عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة ~ 10-15 دقيقة.
10. قم بتجميع نظام الرحلان الكهربائي لتشغيل هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪ بواسطة SDS-PAGE.
    1. قم بتحميل 10 ميكروغرام من البروتين (عينة 13 ميكرولتر) لكل بئر على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪. قم بتحميل سلم الوزن الجزيئي.
    2. بعد تحميل العينة ، قم بتوصيل الأقطاب الموجبة والسالبة لنظام الرحلان الكهربائي بمصدر طاقة للحفاظ على جهد ثابت. في البداية ، ابدأ من 70 فولت لمدة 20 دقيقة لنقل عينات البروتين من هلام التكديس إلى جل الحل. بعد ذلك ، قم بزيادة الجهد إلى 125 فولت وقم بتشغيل الجل لمدة 70-120 دقيقة تقريبا حتى تصل العينات وسلم البروتين إلى نهاية الجل.
    3. بعد الانتهاء من الرحلان الكهربائي ، انقل الجل إلى غشاء PVDF باستخدام نظام النشاف الكهربائي الرطب. نقل لمدة ~ 100 دقيقة عند 100 فولت.
    4. ضع علامة على اللطخة عن طريق عمل قطع صغير على جانب سلم الوزن الجزيئي. استخدم لوحا بلاستيكيا شفافا وقاطعا حادا لقطع اللطخة.
11. قم بسد الغشاء في 4٪ BSA مانع مؤقت لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
12. احتضان اللطخة في محلول الأجسام المضادة الأولية (مضاد تاو عند 1: 5,000) عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. اغسل اللطخة في PBST أربع مرات لمدة 7 دقائق لكل منها.
13. قم بإعداد محلول الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة (IgG المضاد للفأر في 1: 5,000) ، واحتضان اللطخة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل في PBST أربع مرات لمدة 7 دقائق لكل منهما.
14. قم بتطوير اللطخة باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. غطي اللطخة بغلاف بلاستيكي شفاف. الحصول على الصور بواسطة نظام التصوير الكيميائي للتلألؤ الكيميائي باستخدام البرامج ذات الصلة.

الجدول 1: تحضير عينة لمقايسة ربط الأنابيب الدقيقة.

عينة اسم الأنابيب الدقيقة المطلوبة البروتين الرئيسي المطلوب بي إم - جي تي بي - بي تي إكس 1 HCT 116-Control (6.21 ميكروغرام / ميكرولتر) 2 ميكرولتر 9.66 ميكرولتر (60 ميكروغرام) 108.34 ميكرولتر 2 HCT 116-الكركمين 10 ميكرومتر (4.81 ميكروغرام / ميكرولتر) 2 ميكرولتر 16.63 ميكرولتر (80 ميكروغرام) 101.37 ميكرولتر 3 HCT 116-الكركمين 20 ميكرومتر (3.28 ميكروغرام / ميكرولتر) 2 ميكرولتر 30.49 ميكرولتر (100 ميكروغرام) 87.51 ميكرولتر 4 HCT 116-LiCl 25 ملي مولار (5.43 ميكروغرام / ميكرولتر) 2 ميكرولتر 18.42 ميكرولتر (100 ميكروغرام) 99.58 ميكرولتر 5 الإشريكية القولونية تاو 2 ميكرولتر 1 ميكرولتر تاو -352 117 ميكرولتر 6 MT فقط 2 ميكرولتر س 118 ميكرولتر 120 ميكرولتر لكل منهما

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كليات التقنية العليا 116 خلية ATCC سي سي إل -247 MEM (EBSS) هيكلون SH30024.01 طبق 100 مم كورنينج 430161 الجسم المضاد لتاو 13 أبكام AB19030 ديثيوثريتول (DTT) روش 10 708 984 001 درجة حرارة التخزين 2-8 درجة مئوية أجهزة الطرد المركزي ميكرولتر هيتيتش زينتريفوجين ميكرو 200 ص باكليتاكسيل سيجما ألدريتش تي 1912 درجة حرارة التخزين 2-8 درجة مئوية كركم سيجما ألدريتش (فلوكا) 78246 درجة حرارة التخزين 2-8 درجة مئوية الأنابيب الدقيقة (MT) الهيكل الخلوي MT001 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية (مجفف) هيدروكسيد الصوديوم سيغما 72068 كلوريد المغنيسيوم سيجما ألدريتش M2670 GTP سيجما ألدريتش G8877 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية DPBS ويلجين رطل 001-02 سونيك ديمبراتور فيشر ساينتيك نموذج 500 جهاز طرد مركزي فائق بيكمان كولتر أوبتيما L-100 XP ألبومين مصل الأبقار (BSA) سيغما أ 7906 التصوير الجزيئي بيو راد ChemiDoc XRS + يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية كاشف صبغة فحص البروتين بيو راد 500-0006 α-توبولين (11H10) أرنب mAb إشارات الخلية 2125 GAPDH (14C10) أرنب mAb إشارات الخلية 2118 الجسم المضاد للتاو (phospho S396) أبكام AB109390 تاو -352 إنسان سيغما تي 9950 يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية غشاء PVDF بيو راد 162-0177 كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) أفيميتريكس 75819 فحص البروتين بيو راد 500-0006 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية الماعز المضاد للفأر IgG الجسم المضاد الثانوي ثيرموفيشر أ -11005 يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام