مقالة منهجية

عزل CTC من عينة دم كاملة: طريقة للحصول على CTCs من نموذج سرطان القولون والمستقيم في الفئران

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Kochall ، S. ، et al. عزل الخلايا السرطانية المنتشرة في نموذج فأر تقويم العظام لسرطان القولون والمستقيم. J. Vis. إكسب. (2017).

يصف هذا الفيديو بروتوكولا مفصلا لعزل الخلايا السرطانية المنتشرة من عينة الدم الكاملة لنموذج فأر ورم القولون والمستقيم القتل الرحيم. يمكن استزراع CTCs المعزولة واستخدامها في التحليل النهائي المقصود.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. عزل الخلايا السرطانية المنتشرة من عينات الدم الكاملة

ملاحظة: الحصول على الدم عن طريق البزل القلبي عبر الجلد على الفئران المخدرة ، متبوعا بالقتل الرحيم. من الناحية المثالية ، يتم سحب 1,000 ميكرولتر من الدم إلى حقنة مملوءة مسبقا ب 100 ميكرولتر من مضاد للتخثر (حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) أو الهيبارين). استخدم جسما مضادا مضادا ل EpCAM (جزيء التصاق الخلايا الظهارية) للإنسان لتحديد الخلايا الظهارية. يعمل هذا بشكل جيد للغاية إذا تم استخدام خطوط الخلايا الظهارية البشرية في نموذج الفأر. بالنسبة للتطبيقات الأخرى ، قد تكون هناك حاجة إلى أجسام مضادة مختلفة.

  1. إثراء CTC:
    1. املأ مسبقا أنابيب سعة 15 مل بوسط تدرج بكثافة 5 مل وانقل الدم بعناية إلى أنبوب 15 مل.
    2. جهاز طرد مركزي (30 دقيقة عند 300 × جم بدون فرامل) وقم بإزالة المادة الطافية العلوية بعناية.
    3. صب الباقي في أنبوب جديد سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي (15 دقيقة ، 300 × جم مع الفرامل).
    4. استرجع الطور البيني الذي يحتوي على الخلايا أحادية النواة (تخلص من الباقي) واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.
    5. أعد تعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر PBS / 1٪ EDTA وأضف 4 ميكرولتر من الجسم المضاد EpCAM. احتضن لمدة 20 دقيقة على الجليد في الظلام.
  2. الفحص والانتقاء
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت التالي (في ما يلي يشار إليه باسم المخزن المؤقت للقطف): PBS + 10٪ مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) + 1٪ بنسلين / ستربتومايسين (1٪) + 0.8٪ EDTA.
    2. استخدم قلم PAP لرسم دائرة ~ 1 سم في طبق بتري معقم مقاس 6 سم (يمنع السائل من التشتت في الطبق) ، وقم بسحب 700 ميكرولتر من المخزن المؤقت في هذه الدائرة.
    3. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى المخزن المؤقت للقطف 700 ميكرولتر داخل الدائرة. تحقق من كثافة الخلايا بالمجهر. قسم العينة إلى أطباق مختلفة إذا كانت كثيفة جدا.
    4. انتظر حتى تستقر الخلايا (~ 5 دقائق).
    5. قم بفحص قطرة تعليق الخلية بحثا عن الخلايا الملطخة (= إيجابية EpCAM).
    6. بمجرد العثور على الخلية ، اختر الخلية مع المعالج الدقيق وضعها في مخزن مؤقت سعة 50 ميكرولتر اعتمادا على التحليل النهائي المقصود (على سبيل المثال ، المخزن المؤقت لاستخراج الحمض النووي الريبي أو وسط الاستزراع).
    7. اعتمادا على التحليلات النهائية المقصودة ، قم بعزل الخلايا و / أو الوسيطة السالبة ل EpCAM كعناصر تحكم سلبية.
    8. تابع التحليلات النهائية (على سبيل المثال ، زراعة الخلايا ، تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات وسط تدرج الكثافة - Ficoll الخلايا الجذعية - Lymphoprep 7801 ريال استنساخ الأجسام المضادة ل Alexa Fluor 488 CD326 (EpCAM) 9C4 بيو ليجند هاتف: 324210 استنساخ الأجسام المضادة ل Alexa Fluor 488 CD326 (EpCAM) G8.8 بيو ليجند هاتف: 118210 طبق بتري ، ø 60 × 15 مم ، 21 سم² ، فتحة تهوية Greiner bio-one 628102 مجهر ثقافة الخلايا الفلورية لايكا Transferman 4r Micromanipulator إيبندورف سيلترام اير إيبندورف مضخة الشفط متصلة بجهاز المعالجة الدقيقة Dmz العالمي مجتذب القطب الكهربائي الصغير شركة داغان مطلوب لتصنيع الشعيرات الدموية الدقيقة لشفط الخلية المفردة الشعيرات الدموية الزجاجية المنشورية شركة داغان قلم عنق الرحم أبكام محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco لايف تكنولوجيز جي إم بي إتش 14190169 انتقاء المخزن المؤقت مصل ربلة الساق الجنينية (FCS) بيوكروم إيه جي س 0115 انتقاء المخزن المؤقت البنسلين / الستربتومايسين (PenStrep) لايف تكنولوجيز جي إم بي إتش 15140122 انتقاء المخزن المؤقت EDTA روث 8040.1 انتقاء المخزن المؤقت الكيمياء المناعية استنساخ الأجسام المضادة CD326 (EpCAM) المنقى المضاد للإنسان 9C4 بيو ليجند 324201 الكيمياء المناعية EpCAM HRP أرنب مضاد للفأر IgG أبكام أب97046 الكيمياء المناعية EpCAM

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EpCAM EpCAM PBS

مقالات ذات صلة