مقالة منهجية

التشريح المجهري بالليزر: تقنية لعزل خلايا سرطان القولون والمستقيم الغازية من نموذج ثقافة النمط العضوي ثلاثي الأبعاد

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Bullock M. et al. ، التنميط الجزيئي للبيئة المكروية للورم الغازي في نموذج ثلاثي الأبعاد لخلايا سرطان القولون والمستقيم والخلايا الليفية خارج الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2014).

يصف الفيديو تشريح الليزر لنموذج الزراعة العضوية المشتركة ثلاثي الأبعاد بدقة على مستوى الميكرون. في النماذج العضوية ثلاثية الأبعاد ، يتم زراعة المكونات اللحمية مثل الخلايا الليفية ثلاثية الأبعاد مع الخلايا الظهارية السرطانية. يعمل النموذج ثلاثي الأبعاد كأداة تجريبية تمكن من دراسة الغزو وتفاعلات السرطان والسدى في ظروف شبه فسيولوجية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحضير النمط العضوي:

تحضير الجل العضوي المشبع بالخلايا الليفية:

  1. تحضير معلق الخلايا الليفية يحتوي على 5 × 105 خلايا لكل نمط عضوي في DMEM مكمل ب 10٪ FCS و 292 ميكروغرام / مل L-Glutamine.
  2. اصنع المواد الهلامية العضوية على الثلج بالنسب التالية:
    • • 7 مجلدات من كولاجين ذيل الفئران: مزيج ماتريجل (1: 1)
    • • 1 حجم من 10x DMEM مفلتر
    • • 1 حجم FCS
    • • 1 حجم من معلق الخلايا الليفية يحتوي على 5 × 105 الخلايا الليفية
      للحصول على 9 مواد هلامية (1 مل لكل جل) ، قم بإعداد 10 مل واخلطها برفق لتجنب الفقاعات.
  3. أضف 1 مل إلى كل بئر من صفيحة 24 بئرا واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب للسماح للمواد الهلامية بالتماسك. بعد 1 ساعة ، أضف 1 مل DMEM (10٪ FCS) / Glut فوق المواد الهلامية وأعدها إلى الحاضنة طوال الليل.
  4. في اليوم التالي ، قم بالشفط من أعلى المواد الهلامية ولوحة 1 مل من الوسائط التي تحتوي على 5 × 105 خلايا ظهارية CRC.

تحضير صفائح النايلون المطلية بالجل:

  1. قم بإعداد صفائح نايلون معقمة بقياس 1.5 سم × 1.5 سم مقدما.
  2. باستخدام ملقط معقم ، ضع العدد المطلوب من صفائح النايلون في طبق ثقافة مقاس 10 سم (عادة ما يمكن استيعاب 4 صفائح نايلون لكل طبق).
  3. جل المكياج على الثلج بالترتيب التالي (مطلوب حجم إجمالي 250 ميكرولتر لكل ورقة نايلون):
    • • 7 أحجام من كولاجين ذيل الفئران
    • • 1 حجم من 10x DMEM مفلتر
    • • 1 حجم FCS
    • • 1 حجم من DMEM 10٪ FCS / Glut
  4. إذا كان المحلول أصفر ، فقم بتحييد بإضافة 0.1 M من هيدروكسيد الصوديوم في 50 ميكرولتر من الحصص حتى يتحول المحلول إلى اللون الوردي.
  5. أضف 250 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل ورقة نايلون واحتضن عند 37 درجة مئوية في جو مرطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 30 دقيقة للسماح للجل بالتماسك.
  6. مكياج محلول جلوتارالديهايد 1٪ في PBS. أضف 10 مل إلى كل طبق ثقافة 10 سم بمجرد أن يتماسك الجل ويحتضن عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة.
  7. اغسل صفائح النايلون 3x في PBS و 1x في DMEM (10٪ FCS) / Glu واحتضانها طوال الليل في DMEM / Glu عند 4 درجات مئوية.

رفع المواد الهلامية العضوية على شبكات فولاذية للغزو:

  1. قم بإعداد شبكات السقالات مسبقا عن طريق طي ألواح الفولاذ المقاوم للصدأ في تشكيل حامل ثلاثي القوائم. الأوتوكلاف قبل الاستخدام.
  2. استخدم ملقطا معقما بالإيثانول لوضع شبكة فولاذية في كل بئر من صفيحة من ستة آبار.
  3. ضع ورقة نايلون مغطاة بالهلام مع جانب الكولاجين العلوي على كل شبكة.
  4. انقل المواد الهلامية العضوية بعناية من اللوحة المكونة من 24 بئرا إلى لوح النايلون المرتفع باستخدام ملعقة معقمة بالإيثانول.
  5. املأ البئر ب DMEM 10٪ FCS / Glut مع 10٪ FCS حتى تتلامس لوح النايلون مع الوسط ولكن غير مغمورة. تأكد من أن الوسيط لا يلمس الجل العضوي.
  6. احتضن لمدة 14 يوما عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، واستبدال الوسائط كل يومين.

< p class = "jove_title" >2. تثبيت النمط العضوي

  1. قم بإزالة النمط العضوي بالكامل بما في ذلك ورقة النايلون من البئر وضعها على غلاف بلاستيكي.
    2. قم
  2. بتقسيم صفيحة عضوية ونايلون باستخدام مشرط نظيف يمكن التخلص منه وقم بتثبيت كلا النصفين في الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  3. استبدل الفورمالديهايد بنسبة 70٪ من الإيثانول بعد 24 ساعة واتركه طوال الليل قبل تضمينه في البارافين والتقطيع والتلطيخ.
فئة

3. التشريح المجهري بالليزر للهامش الغازي

  1. قسم يصل سمكه إلى 10 ميكرومتر على شرائح مثبتة على الغشاء.
  2. قم بإزالة الأقسام عن طريق تطبيق الزيلين لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بإزالة الزيلين وإصلاح 75٪ من الإيثانول لمدة 1 دقيقة أخرى.
  3. قم بإزالة الإيثانول والبقع بمحلول Cresyl Violet بنسبة 0.125٪ لمدة 1 دقيقة.
  4. قم بإزالة Cresyl Violet وقم بتطبيق الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة 1 دقيقة أخرى قبل شطفه بالإيثانول بنسبة 100٪. اترك الشرائح تجف في الهواء لمدة 30 دقيقة.
  5. قم بإجراء التشريح الدقيق بالليزر باستخدام المنصة المختارة (على سبيل المثال ، نظام Leica AS).
  6. ضع الشريحة الزجاجية مع القسم الملون لتشريح مجهري ووجهه لأسفل على مرحلة المجهر.
  7. قم بتركيب أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 مل في كاسيت التجميع وأضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية (على سبيل المثال ، الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو المخزن المؤقت لتحلل البروتين) إلى الغطاء الذي ستتجمع فيه الأنسجة التشريح المجهري.
  8. تحت الرؤية المباشرة ، استخدم عصا التحكم لتحديد الأنسجة ذات الاهتمام. باستخدام واجهة البرنامج ، قم بالتعليق على القسم العضوي الملون ، مع تمييز الخلايا المراد تشريحها المجهري في جبهة غزو الورم.
  9. اطلب من الليزر إطلاق النار ، والذي يجب أن يقطع القسم المميز ويدفع الأنسجة التشريح الدقيق إلى غطاء أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
  10. بمجرد جمع مادة كافية ، قم بإخراج كاسيت التجميع ، وأغلق أنبوب الطرد المركزي الدقيق وقم بالدوران برفق لسحب المخزن المؤقت للتحلل إلى قاع الأنبوب.
  11. ضع العينات على الثلج حتى يكتمل التشريح المجهري. معالجة العينات بطريقة مناسبة لاستخراج المادة التحليلية ذات الاهتمام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم - مثال موضح SW480 ATCC ATCC CCL-228 الكولاجين BD Biosciences 354265 ماتريجيل BD Biosciences 354234 غشاء النايلون ميرك ميليبور VVLP01300 شبكة معدنية شركة ذا مش WSS20-A4 themeshcompany.com منصة التشريح المجهري بالليزر لايكا مايكروسيستمز لايكا إيه إس إل إم دي الشرائح المثبتة على الغشاء الأجهزة الجزيئية كريسيل بنفسجي ميرك ميليبور 1052350025

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة