فحص الهيكل الخلوي وتنظيم الالتصاق البؤري: طريقة قائمة على التألق المناعي لدراسة التصاق الخلايا وانتشارها على الركائز

الملخص

المصدر: Ali ، M. Y et al. ، عزل خلايا ورم القولون البشري الأولية من الأنسجة الجراحية وزراعتها مباشرة على ركائز مرنة ناعمة لقياس الجر الخلوي. J. Vis. Exp. (2015)

يصف هذا الفيديو تقنية دراسة الهيكل الخلوي والتصاقات البؤرية في خلايا سرطان القولون البشري الأولية لفهم اختلافاتها اعتمادا على صلابة الركيزة. تسمح هذه الثقافة للخلايا السرطانية على ركائز ناعمة وصلبة بإجراء قياسات فيزيائية حيوية مختلفة لتشخيص السرطان.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. فحوصات الفحص المجهري المناعي

1. خذ الركائز مع الخلايا ليتم تلطيخها مناعة على الغطاء الصفحي وإزالة وسائط الزراعة.
2. اشطف الركائز باستخدام PBS وقم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 20 دقيقة في RT.
3. اغسل الركائز باستخدام PBS ثلاث مرات (5 دقائق في كل مرة). وبالتالي ، احتضان الركائز بمحسن إشارة 500 ميكرولتر لمدة 30 دقيقة واشطفها باستخدام PBS.
4. احتضان الخلايا بالجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للفينكولين عند تخفيف 1: 250 في PBS لمدة 45 دقيقة في RT. ثم اغسل الركائز باستخدام PBS 3 مرات (5 دقائق في كل مرة).
5. احتضان العينات بالجسم المضاد الثانوي Alexa Fluor 488 IgG المضاد للفأر عند تخفيف 1: 200 في PBS عند RT لمدة 30 دقيقة. اغسل الركائز باستخدام PBS 3 مرات (5 دقائق في كل مرة).
6. لتصور بنية F-actin ، احتضان الخلايا مع اقتران الفالودين TRITC بتركيز 50 ميكروغرام / مل لمدة 45 دقيقة في RT. ثم اغسل الركائز باستخدام PBS 3 مرات (5 دقائق في كل مرة).
7. قم بتصوير العينات باستخدام مجهر ليزر ماسح متحد البؤر (الشكل 1A-1D).

النتائج

الشكل 1. تلطيخ الفلورسنت المناعي ل F-actin و vinculin على ركائز هلامية ناعمة وبوليسترين صلب.لم تكن هناك ألياف أكتين موجودة في الخلية السرطانية الأقل انتشارا (A1) أو الخلية الطبيعية (A2) على المواد الهلامية الناعمة 2 كيلو باسكال. ومع ذلك ، فإن الالتصاقات البؤرية المحتوية على الفينكولين موجودة على المواد الهلامية الناعمة (B1-B2).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكواشف برنامج تلفزيوني لونزا 17-516 فهرنهايت بارافورمالدهيد علوم المجهر الإلكتروني RT15710 محسن الإشارة تقنيات الحياة رقم I36933 الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للفينكولين سيجما ألدريتش ف9131 Alexa Fluor 488 الماعز المضاد للفأر IgG تقنيات الحياة أ 11001 TRITC الفالويدين المترافقات سيجما ألدريتش ص 1951 المواد زلات غطاء زجاجي 12 مم 2 كورنينج 2865-12