تحضير كتلة أنسجة الجلد المجمدة: بروتوكول للحفاظ على عينات الورم الميلانيني الجلدي من الجلد الظهري للفأر

الملخص

المصدر: Moon ، H. ، et al. التحكم المكاني والزماني في بدء الورم الميلانيني الفأري من الخلايا الجذعية الطافرة للخلايا الصباغية. J. Vis. Exp. (2019)

يصف هذا الفيديو البروتوكول التفصيلي لعزل جلد الفئران الظهري المحتوي على سرطان الجلد ، متبوعا بالتضمين بالتبريد لتحضير كتلة أنسجة الجلد المجمدة. يمكن تقطيع كتلة الأنسجة المضمنة بالتبريد وفحصها مجهريا لدراسة تطور الورم الميلانيني.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية المحلية لرعاية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

فئة

1. معالجة الأنسجة

1. عزل الجلد
   1. احصل على ما يلي قبل البدء: أدوات التشريح وورق الترشيح والمناشف الورقية.
   2. القتل الرحيم للفئران وفقا للبروتوكولات المعتمدة ، وتأكيد الوفاة قبل المضي قدما.
   3. باستخدام ماكينة قص الشعر ، احلق أي شعر من منطقة الجلد الظهري. قم بتنظيف المنطقة برفق بمنديل خال من النسالة لتنظيف المنطقة.
   4. قم بعمل شق صغير بمقص حاد فوق قاعدة الذيل مباشرة.
   5. أدخل مقصا حادا كبيرا في الشق وافصل الأنسجة الضامة تحت الجلد.
   6. اعزل منطقة الجلد التي تهم بعناية عن طريق القطع بمقص حاد على طول حافة الأنسجة.
   7. ضع أنسجة الجلد على منشفة ورقية نظيفة واستخدم ملقطا باهتا لتمديد الجلد بحيث يلتصق بالمنشفة ويكون مشدودا. تعمل هذه الخطوة على توفير دعم إضافي للأنسجة بحيث يمكن التلاعب بها ومعالجتها مع الحفاظ على شكلها.
      ملاحظه: احرص على التعامل مع المناطق الخارجية من أنسجة الجلد فقط ، لأن الملقط قد يتسبب في تلف الجلد الذي يمكن رؤيته من الناحية النسيجية.
2. تثبيت الأنسجة
   1. قم بطي قطعة من ورق الترشيح إلى نصفين وقم بتسميته بشكل مناسب. ضع الجلد مع دعامة منشفة ورقية في الورق المطوي المجاور مباشرة للتجعد ، مع التأكد من أن العينة ناعمة وغير مطوية أو مجعدة. أغلق ورق الترشيح عن طريق تدبيس الجوانب المفتوحة، ثم قم بقصه بحيث يمكن استخدام الورق المتبقي للعينات المستقبلية.
      ملاحظه: يتم تنفيذ هذه الخطوة بحيث يحتفظ الجلد بشكله أثناء التثبيت.
   2. اغمر عينة الأنسجة بالكامل في الفورمالين المحايد المخزن المؤقت بنسبة 10٪ لمدة 3 إلى 5 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   3. بعد التثبيت ، قم بإزالة العينات من الفورمالين ، واغسلها بالماء منزوع الأيونات (2 × 5 دقائق لكل منهما) واستمر في عمل كتل الأنسجة. قم بإزالة أي مادة متبقية من أنسجة الجلد بعناية (أي الورق المتبقي).
3. صنع كتل الأنسجة المجمدة (الشكل 1)
   1. قم بقص حواف عينة الجلد حتى لا تكون خشنة ثم قم بعمل 3 جروح سهمية. يجب ألا يزيد عرض هذه الشرائط عن ارتفاع cryomold (5 مم). بعد ذلك ، قم بعمل قطع عرضية للحصول على قطع من الجلد لا تزيد عن عرض التبريد (20 مم) ويمكن تضمينها. كرر مع النصف المتبقي من الجلد الظهري ، أو احتفظ بالأنسجة لاستخدامات أخرى (بالتناوب ، احتفظ بالنصف قبل التثبيت).
      ملاحظه: من المهم الحفاظ على قطع الجلد في الاتجاه الصحيح.
   2. قم بتوجيه cryomold (25 × 20 × 5 مم³) في اتجاه عمودي وضع 4 إلى 5 قطع من الجلد فوق OCT. بمجرد وضع جميع القطع في مكانها ، استخدم زوجين من الملقط الدقيق لإحضار الحافة الطويلة للجلد إلى أسفل القالب المبرد. يجب أن يقف الجلد الآن في OCT عموديا على قاعدة القالب. احرص على تقليل تكوين الجيوب الهوائية داخل OCT خلال هذه الخطوة (الشكل 1).
   3. املأ القالب ب OCT إلى الشفة الثانية ، وضعه على سطح مستو من الثلج الجاف. استخدم الملقط لضبط أي قطع جلد قد تكون قد تحولت أثناء النقل عندما تبدأ الكتلة في التجمد. بمجرد ترسيخ الطبقة السفلية ، سيكون التلاعب بالأنسجة مستحيلا.
   4. قص شرائح 8-10 ميكرومتر للتحليل.
4. صنع كتل الأنسجة المدمجة في البارافين الثابت (FFPE)
   1. ضع قطعتين من الجلد الثابت في كاسيت مكتوب عليه علامة وقم بتجفيفها بتركيزات متزايدة من الإيثانول (75٪ إيثانول لمدة 30 دقيقة ، 85٪ لمدة 30 دقيقة ، 90٪ لمدة 30 دقيقة ، 95٪ لمدة 30 دقيقة ، 100٪ لمدة 2 × 30 دقيقة ، بديل الزيلين أو الزيلين لمدة 2 × 30 دقيقة). احتضن البارافين عند 58-60 درجة مئوية ، أولا لمدة 30 دقيقة ثم طوال الليل.
   2. قم بتضمين الأنسجة في قالب مناديل من الفولاذ المقاوم للصدأ مقاس 24 × 24 مم² مع البارافين السائل وتصلب عند -5 درجة مئوية. يجب أن يكون اتجاه الأنسجة مشابها لاتجاه كتل الأنسجة المجمدة بحيث يمكن تصور المقاطع الطولية عبر بصيلات الشعر المتعددة (الشكل 1).
   3. بمجرد أن يصلب البارافين ، قم بإزالة القالب وتقطيعه إلى أقسام 5-10 ميكرومتر لتحليلها.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: عزل أنسجة الجلد وتضمينها بالتبريد. بعد القتل الرحيم، حلق منطقة الجلد الظهري للفأر محل الاهتمام وقم بتضمين الجلد في التبريد الذي يحتوي على OCT. يمثل الخط المنقط على الماوس خط الوسط. عادة ، يمكن عزل 3 أو 4 قطع من الجلد بقطعة الخط 3-4 على طول خط الوسط. يشار إلى إحدى هذه القطع بمستطيل 1/2/3/4. يجب تضمين قطع الجلد هذه في OCT كما هو موضح في الشكل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ماكينة تشذيب شعر الأليفة وال 09990-502 كريم إزالة الشعر نير غير متاح متوفر في معظم الصيدليات مسحات القطن مختلف لمبة الأشعة فوق البنفسجية الأشعة فوق البنفسجية 95-0042-08 نموذج XX-15M مصباح الأشعة فوق البنفسجية متوسط المدى 200 دليل على الإيثانول مختلف الإيثانول النقي هيستوبلاست PE فيشر ساينتيك 22900700 حبيبات البارافين فورمالين محايد مخزن مؤقت ، 10٪ سيغما HT501128-4 لتر O.C.T. كمبوند الحراريه 23730571 كاسيت المناديل ساكورا 89199-430 لمعالجة FFPE قوالب التبريد ساكورا 4557 25 × 20 ملم قالب معدني FFPE لايكا 3803082 24 مم × 24 مم إيزوفلوران مختلف الصف البيطري نظام استنشاق التخدير مختلف الصف البيطري مقص ناعم FST 14085-09 مستقيم وحاد / حاد مقص ناعم FST 14558-09 مستقيم وحاد / حاد ملقط FST 11252-00 دومون # 5 ملقط FST 11018-12 مايكرو أدسون تير كرير. LSL-BrafV600E ؛ Pten f / f جاكسون لابز 13590 [م] LSL-tdطماطم جاكسون لابز 7914 AI14