نمذجة الطعم الغريب المشتق من المريض: تقنية لتوليد نماذج فأر الورم الميلانيني

الملخص

المصدر: Min Xiao et al. نموذج Xenograft مشتق من الورم الميلانيني المشتق من المريض. J. Vis. Exp. (2018)

في هذا الفيديو ، يتم زرع خلايا الورم الميلانيني المشتقة من الإنسان تحت الجلد في منطقة الجناح لفأر يعاني من نقص المناعة. يسمح نموذج PDX بالتحقيق قبل السريري لخلايا الورم الميلانيني التي تلخص بشكل أفضل عدم تجانس الورم وعدوانية الورم الميلانيني التي لوحظت في ظروف الجسم الحي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. معالجة أنسجة الورم لزرع الفأر

1. الاستئصال الجراحي أو معالجة أنسجة الخزعة الجراحية
   1. انقل الأنسجة إلى طبق بتري معقم وافصل أنسجة الورم عن الأنسجة الطبيعية المحيطة قدر الإمكان.
   2. قم بإزالة الأنسجة الميتة (التي تعرف عادة على أنها أنسجة بيضاء شاحبة تقع مركزيا داخل الورم) من الورم المتبقي قدر الإمكان.
   3. استخدم مشرطا لتقسيم قطعة الورم الأولية إلى قطع متساوية تقريبا (~ 3 مم × 3 مم) لزرع الفأر الجراحي (الشكل 1).
   4. اختياريا ، إذا كان هناك ما يكفي من الأنسجة الورمية المتاحة ، فقم بتجميد الأنسجة لإجراء فحوصات المصب (تسلسل الحمض النووي الريبي [RNASeq] ، وتسلسل الإكسوم الكامل [WES] ، وما إلى ذلك).
   5. اصنع ملاط للورم عن طريق فرم أنسجة الورم باستخدام تقنية الشفرة المتقاطعة بشفرتين من مشرط. افرم قطع الورم بأكبر قدر ممكن من النعومة لتشكيل ملاط جاهز الآن لزرع الفأر الجراحي.
   6. بدلا من ذلك ، إذا كان نسيج الورم صعبا جدا للتفكك الميكانيكي ، فاستخدم إجراء تفكك الهضم لتشكيل ملاط يشبه الهلام وتعليق أحادي الخلية للزرع و / أو الحقن.
      1. افرم قطع الورم بأكبر قدر ممكن من النعومة لتشكيل ملاط.
      2. ضع الملاط في أنبوب سعة 50 مل مع محلول ملح هانك المتوازن البارد (HBSS) ^{- / -} (بدون Ca ⁺⁺ و Mg ⁺⁺) ؛ ثم قم بالطرد المركزي للحبيبات عند 220 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      3. أعد تعليق الملاط في 10 مل من وسائط الهضم الطازجة الدافئة (200 وحدة / مل كولاجيناز IV + 5 ملي CaCl₂ + 50 U / مل DNase في HBSS ^-/-) لكل 1 جرام من أنسجة الورم.
      4. ضع الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة واخلطه بقوة كل 5 دقائق باستخدام ماصة يمكن التخلص منها.
      5. يغسل بما يصل إلى 50 مل من HBSS ^{- / -} ؛ ثم جهاز طرد مركزي عند 220 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      6. أضف 5 مل من TEG الدافئ مسبقا (0.025٪ تربسين + 40 ميكروغرام / مل إيثيلين جلايكول مكرر (β-أمينوإيثيل الأثير) -N ، N ، N '، N'، N'-حمض رباعي الأسيتيك [EGTA] + 10 ميكروغرام / مل كحول البولي فينيل [PVA]) لكل 1 غرام من أنسجة الورم ، وقم بتعليقه / رجه برفق ، وضع الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين دون خلط.
      7. أضف ما لا يقل عن 1 حجم متساو من وسائط التلوين الباردة (1٪ ألبومين مصل بقري [BSA] + 10 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض [HEPES] + 1x البنسلين - الستربتومايسين في وسائط L15) لإخماد التربسين وأجهزة الطرد المركزي عند 220 × جم لمدة 4 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      8. أعد تعليق العينة في 10 مل من وسائط التلوين لكل 1 جرام من أنسجة الورم وقم بتصفيتها من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر للحصول على تعليق أحادي الخلية لحقن الفأر (الشكل 1).
      9. يمكن أيضا جمع الملاط المتبقي أعلى مصفاة الخلية لزرع الفأر الجراحي.
2. زرع الورم وحقنها في الفئران
   1. زرع الاستئصال الجراحي أو أنسجة الخزعة الجراحية
      ملاحظه: تأكد من أن جميع الأدوات الجراحية معقمة عن طريق التعقيم أو استخدام أدوات يمكن التخلص منها مسبقا.
      1. احلق الشعر من أسفل ظهر الفئران من الذكور أو الإناث من 6 إلى 8 أسابيع مع ترك مساحة 1.5 سم × 3 سم تقريبا بدون شعر. قم بتخدير الفئران باستخدام الأيزوفلوران وتأكيده عن طريق الضغط برفق على القدم كاختبار للاستجابة. استخدم مرهما بيطري على عيونهم لمنع الجفاف.
      2. ضع الفئران الفردية على وسادة حرارية في مخروط الأنف لآلة التخدير ، وافرك المنطقة المحلوقة بالكلورهيكسيدين. ثم اغمسها بنسبة 70٪ من الإيثانول واتركها تتبخر.
      3. قم بإعداد قطع أو قسم ملاط الورم في طبق بتري إلى أكوام فردية للزرع الجراحي (أي في ثلاثة أكوام متساوية إذا تم زرعها في 3 فئران).
      4. باستخدام شفرة المشرط ، قم بعمل شق بطول 5 مم تقريبا في منتصف الجزء الخلفي من الماوس ، وخذ زوجا واحدا من الملقط وارفع الجلد على جانب الشق المقابل للمشغل.
      5. خذ المقص في اليد الأخرى وافصل الجلد عن طبقة العضلات عن طريق قطع الغشاء اللفافي برفق بقطع مقصية صغيرة ، وبالتالي إنشاء "جيب" لأنسجة الورم.
      6. التقط قطعة ورم واحدة أو كومة فردية واحدة من أنسجة ملاط الورم بشفرة المشرط وضع الأنسجة برفق في الجيب الذي تم إنشاؤه.
      7. قم بإدارة 100 ميكرولتر من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية على كومة أنسجة الورم في الجيب.
      8. باستخدام زوجين من الملقط ، اسحب الشق على كلا الطرفين بحيث تقترب حواف الجرح من بعضها البعض ، وأغلق الجرح عن طريق تطبيق مقطع أو اثنين من مقاطع الجرح.
      9. حقن تحت الجلد 1-5 مجم / كجم ميلوكسيكام كمسكن في الفئران بعد الجراحة.
      10. أخرج الفأر من مخروط الأنف وضعه مرة أخرى في قفصه الأصلي ؛ راقب الفأر أثناء الاستيقاظ. لا تعود إلى القفص حتى تتعافى تماما.
      11. قم بإزالة مشابك الجرح بعد حوالي 7 أيام. إذا لم يكتمل الشفاء بعد 7 أيام ، اترك مشبك الجرح لمدة يوم أو يومين إضافي><ين. ملاحظه: في حالة استخدام تعليق خلية واحدة من الاستئصال الجراحي أو معالجة أنسجة الخزعة الجراحية ، فسوف يختلط مع مصفوفة اصطناعية خارج الخلية (بنسبة 1: 1) لحقن الفئران.
   2. حقن FNA أو أنسجة الخزعة الأساسية
      1. ضع ماوس NSG على رف شبكي فولاذي ، وأمسك الماوس بإحكام من الذيل ، واسحب الماوس برفق للخلف. سوف تمسك الشبكة بأرجلها الأمامية بإحكام. بدلا من ذلك ، قم بتقييد الماوس في اليد غير المهيمنة واترك منطقة الجناح مرئية.
      2. تطهير جلد الجناح بمسحات تحضير الكحول. ببطء وثبات حقن محتويات المحقنة تحت جلد الماوس.
      3. اسحب الإبرة وضع الماوس مرة أخرى في قفصه.
3. مراقبة نمو الورم
   1. راقب الفئران مرة واحدة أسبوعيا للتحقق من وجود أورام ملموسة.
   2. بمجرد أن تصبح الأورام بحجم قابل للقياس (حوالي 50 مم³) ، استخدم الفرجار لتسجيل أبعاد الورم. استخدم الصيغة التالية لحساب أحجام الورم: (العرض × العرض × الطول) / 2.
   3. حصاد الورم بمجرد أن يصل حجم الورم إلى حوالي 1.5 سم³ (حوالي 4-10 أسابيع). يطلق على الورم الآن اسم ممر الفأر 1 (MP1).

النتائج

الشكل 1: طرق الزرع البديلة.(أ) يمكن معالجة الأورام إما إلى قطع أو تعليق الملاط أو كمعلق أحادي الخلية. (ب) ستسمح الطرق الثلاث بنمو الأورام في الجسم الحي. تظهر هنا الفئران المزروعة تحت الجلد مع الورم وتم تصويرها بعد 12 يوما من الزرع. (ج) تظهر منحنيات نمو الورم للفئران التي تم حقنها بإحدى طرق الزرع الثلاث. N = 5 لكل ذراع ؛ أشرطة الخطأ هي خطأ قياسي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1 م هيبس شركة سيجما ألدريتش القط # H0887-100ML 100x PenStrep إنفيتروجين القط # 15140163 1x HBSS-/- (بدون Ca ++ أو Mg ++) ميد قطة # MT21-023-CV 2.5٪ تريبسين شركة سيجما ألدريتش قطة # T4549-100ML 10 مل من الحصص المخزنة عند -20 درجة مئوية جيش صرب البوسنه شركة سيجما ألدريتش قطة # A9418-500G الكلورهيكسيدين فيشر ساينتيك القط # 50-118-0313 الكولاجيناز الرابع (2,000 وحدة / مل) ورثينجتون قطة # 4189 المكياج في HBSS - /- من مخزون مسحوق Collagenase IV (Worthington # 4189 ، u / mg المشار إليه على الزجاجة ويختلف باختلاف كل دفعة) ؛ تجميد 1 DMSO شركة سيجما ألدريتش القط # C6295-50ML DNase شركة سيجما ألدريتش قطة # D4527 EGTA (الإيثيلين جلايكول مكرر (2-أمينوإيثيل الأثير) -N ، N ، N'N '- حمض رباعي الأسيتيك) ميرك قطة # 324626.25 FBS تقنيات INVITROGEN LIFE قطة # 16000-044 Fungizone تقنيات INVITROGEN LIFE قطة # 15290-018 الجنتاميسين فيشر ساينستيف القط # BW17518Z إيزوفلوران هنري شاين لصحة القط # 050031 وسائط Leibovitz L15 إنفيتروجين القط # 21083027 ماتريجيل كورنينج قطة # 354230 مصفوفة اصطناعية خارج الخلية ميلوكسيكام هنري شاين صحة # ::هنري شاين القط # 025115 1-5 مجم / كجم كمسكن للألم الفئران الفارغة لمستقبلات NOD / SCID / IL2 (NSG) معهد ويستار ، منشأة للحيوانات تربيه PVA (كحول البولي فينيل) شركة سيجما ألدريتش قطة # P8136-250G RPMI 1640 متوسط (Mod.) 1X مع L-Glutamine فيشر ساينتيك القط # MT10041CM مشرط ريشة قطة # 2976-22 مقاطع الجرح ميكرون القط # 427631