طريقة السقوط المعلق: تقنية لتوليد كرويات الورم الميلانيني ثلاثية الأبعاد

الملخص

المصدر: Müller ، I. et al. ، نموذج الجلد الكروي ثلاثي الأبعاد للورم الميلانيني العضوي. J. Vis. Exp. (2018)

يصف هذا الفيديو تقنية توليد كرويات ثلاثية الأبعاد عبر طريقة السقوط المعلق باستخدام خلايا الورم الميلانيني. يمكن للنموذج الكروي للورم الميلانيني العضوي ثلاثي الأبعاد (3D) الذي تم إنشاؤه في المختبر أن يصور الهندسة المعمارية في الجسم الحي للورم الميلانيني الخبيث وقد يعطي نظرة ثاقبة للتفاعلات داخل الورم.

البروتوكول

فئة

1. توليد كرويات الورم الميلانيني ثلاثية الأبعاد عبر طريقة الإسقاط المعلقة

1. زراعة خلايا الورم الميلانيني (على سبيل المثال ، 451-LU ، أو أي خط خلية ورم ميلانيني ذي أهمية) وفقا للبروتوكولات العامة ، باستخدام RPMI الذي يحتوي على 10٪ FCS.
   1. لتوليد كرويات الورم الميلانيني ذات الحجم والجودة المتشابهة ، اغسل خلايا الورم الميلانيني في PBS ، وأضف 5 مل من 1x Trypsin-EDTA في PBS إلى الخلايا في قارورة ثقافة الخلايا T175 ، واحتضانها لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). قم بتحييد التربسين بإضافة 5 مل RPMI/10٪ FCS. حصاد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في RPMI/FCS بتركيز نهائي قدره 10,000 خلية/مل كما هو محدد عن طريق العد في مقياس كثافة الدم.
ضع
2. 40 × 25 ميكرولتر (= 250 خلية) من معلق الخلية على السطح الداخلي لغطاء طبق ثقافة الخلايا المعقم غير اللاصق (Ø 10 سم) باستخدام ماصة إلكترونية متعددة. بحركة سريعة ولكنها سلسة ، اقلب الغطاء وضعه على طبق زراعة الخلايا المعني الذي يحتوي على 5 مل من PBS.
   1. استزراع "أطباق إسقاط معلقة" في حاضنة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 10-14 يوما ، اعتمادا على نوع الخلية المستخدمة.
      ملاحظه: عادة ما تنمو الخلايا من مرحلة نمو الورم الميلانيني النقيلي بشكل أسرع وتشكل كرويات أكثر صلابة في القطرة المعلقة مقارنة بخلايا الورم الميلانيني المشتقة من مرحلة النمو الشعاعي أو مرحلة النمو الرأسي. للتقييم الفردي ، لاحظ نمو كروي تحت زوج من المناظير أو تحت المجهر الضوئي (تكبير 4X). عادة ، تصبح الكرويات قابلة للاكتشاف بعد 48 ساعة تحت زوج من المناظير أو تحت المجهر الضوئي (تكبير 4X). بعد 10-14 يوما ، تكون مرئية بدون أي جهاز تكبير.
3. بعد خمسة أيام من اكتشاف القطرات الأولية ، أضف 10 ميكرولتر من RPMI الطازج / 10٪ FCS المتوسطة إلى كل قطرة. بعد ذلك ، استبدل 10 ميكرولتر من الوسط كل يومين. يعد استخدام الموزع الإلكتروني مفيدا جدا في هذه الخطوة.
4. اعتمادا على نوع الخلية ، احصد الكرويات بعد 10-15 يوما. اشطف الكرات بعناية من غطاء طبق ثقافة الخلايا المتساقطة المعلق باستخدام PBS. اجمع 10-20 من الكرات الكروية في طبق ثقافة خلوي معقم غير لاصق. قم بإزالة PBS الزائد بعناية باستخدام ماصة باستور.
   ملاحظه: تعتمد فترة الزراعة على مرحلة نمو الورم لخلايا الورم الميلانيني عندما تم اشتقاقها في البداية ، على سبيل المثال ، تنمو الكرويات المشتقة من خلايا 451-LU إلى ما يقرب من 500 ميكرومتر في القطر في غضون 12 يوما من الاستزراع في القطرة المعلقة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ألبومين مصل الجنين (FCS) ثيرمو فيشر العلمي 10270106 أضف 10٪ إلى وسط زراعة الخلايا التربسين EDTA ثيرمو فيشر العلمي 25300054 1X خفف في PBS RPMI ثيرمو فيشر العلمي 61870010 لزراعة خطوط خلايا الورم الميلانيني