توليد إعادة بناء الجلد الكامل العضوي: إجراء لإنشاء نموذج جلدي ثلاثي الأبعاد باستخدام عينات من الجلد البشري

الملخص

المصدر: Müller, I. et al. نموذج الجلد الكروي ثلاثي الأبعاد للورم الميلانيني العضوي. J. Vis. Exp. (2018)

يصف هذا الفيديو البروتوكول التفصيلي لإنشاء إعادة بناء الجلد العضوي ثلاثي الأبعاد في المختبر لدراسة تطور الورم الميلانيني. يحاكي نموذج الجلد هذا كلا من الهندسة المعمارية والتعقيد متعدد الخلايا للأعضاء في الجسم الحي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. عزل الخلايا الكيراتينية الأولية عن البشرة

1. اغسل أنسجة البشرة باستخدام PBS. قطع البشرة إلى قطع أصغر (1 مم²) وجمعها في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 10 مل 1x Trypsin-EDTA (مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية) واحتضنه لمدة 5 دقائق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
2. أوقف التفاعل الأنزيمي عن طريق إضافة 1 مل من مصل ربلة الساق الجنينية (FCS). أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة بلاستيكية سعة 10 مل لمدة 4 دقائق. حاول تجنب تكوين الفقاعات والرغوة.
3. قم بسحب تعليق الخلية في مصفاة خلوية (حجم المسام 100 ميكرومتر) ، يوضع فوق أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل ، ويشطف 3x مع 5 مل PBS. الطرد المركزي للخلايا عند 200 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط استزراع 2-6 مل يحتوي على 1٪ (v / v) gentamycin. حدد رقم الخلية يدويا عن طريق عد الخلايا في مقياس كثافة الدم وبذرة 6 × 10⁵ خلايا في قارورة ثقافة الخلايا T75.

< p class = "jove_title" >2. عزل الخلايا الليفية الأولية عن الأدمة

1. قطع الأنسجة الجلدية إلى قطع أصغر (1 مم²) ونقلها إلى أنبوب مخروطي 50 مل. أضف 10 مل من محلول الكولاجيناز (5 U / مل في PBS ⁺) واحتضنه لمدة 45 دقيقة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
2. اغسل حبيبات الخلية مرتين باستخدام 10 مل DMEM يحتوي على 4.5 جم / لتر من الجلوكوز و L-Glutamine ، ولكن بدون L-Pyruvate. أخيرا ، أعد تعليق قطع المناديل في 2 مل من DMEM التي تحتوي على 1٪ (v / v) gentamycin و 10٪ FCS. انقلها إلى قارورة ثقافة خلية T25 واحتضانها في حاضنة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: يسمح الحجم الصغير للأرومات الليفية بالهجرة خارج بقايا الأنسجة ويجبرها على الالتصاق بقارورة الثقافة.
3. في صباح اليوم التالي ، أضف 6 مل أخرى من DMEM / Gentamycin / FCS واحتضن لمدة 2-3 أيام عند 37 درجة مئوية حتى تصل الخلايا إلى 80-90٪ من التقاء.

فئة

3. توليد الحجرة الجلدية من إعادة بناء الجلد الكامل العضوي

1. قم بإنشاء نماذج جلدية باستخدام إدخالات غشائية صغيرة يسهل اختراقها من 24 بئرا (حجم المسام 8 ميكرومتر) موضوعة في ألواح 24 بئرا.
   ملاحظه: تأكد من عدم استخدام الإدخالات المعلقة ولكن الدائمة ، لأنه سيتم وضعها في صفيحة من 6 آبار لزراعة سائل الهواء في مرحلة لاحقة.
2. قم بإعداد محلول تحييد الهلام (GNL) ، بالإضافة إلى وسائط الثقافة المشار إليها باسم MM ووسائط النمو البطاني (EGM). لمنع التخثر ، قم بتخزين الكولاجين من النوع الأول (عادة من ذيل الفئران ، 3.5-4 مجم / مل في 0.02 نيوتن حمض الخليك) على الثلج حتى استخدامه لأنه يبدأ في الهلام في RT.
3. أعد تعليق 1 × 10⁵ الخلايا الليفية لكل إدخال في GNL واخلط معلق الخلية بسرعة مع الكولاجين بنسبة 1: 3 في الحجم النهائي 500 ميكرولتر / إدراج. امزج عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل لتجنب تكون الفقاعات لأن الفقاعات قد تضعف جودة إعادة بناء الجلد.
4. اسمح للمواد الهلامية الجلدية الفردية بالاستقرار عن طريق إبقائها بدون وسيط في RT لمدة 30 دقيقة في غطاء معقم. بعد ذلك ، قم بتغطية كل هلام ب DMEM يحتوي على 4.5 جم / لتر جلوكوز ، و 1٪ L-glutamine ، و 10٪ FCS ، وبدون L-pyruvate ، واحتضانه طوال الليل عند 37 درجة مئوية.

< p class = "jove_title" >4. توليد حجرة البشرة من إعادة بناء الجلد الكامل العضوي

1. في اليوم التالي ، قم بإزالة الوسط من المواد الهلامية الجلدية وقم بتوازينها بوسائط EGM (10٪ FCS ، 1٪ PenStrep ، 10 مجم / مل جنتاميسين) لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. اسحب الوسط وبذرة بعناية 1 × 10⁵ خلايا كيراتينية معلقة في 100 ميكرولتر من EGM فوق الجل الجلدي.
2. احتضان عمليات إعادة البناء لمدة 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية للسماح للخلايا الكيراتينية بالالتصاق بالحجرة الجلدية.
   ملاحظه: خلال فترة الحضانة هذه ، ستبدأ المواد الهلامية في الانكماش بسبب الانكماش الناجم عن الخلايا الليفية ، وبالتالي تنفصل جزئيا على الأقل عن جدران الإدخال.
3. قم بتغطية مكافئات الجلد بحوالي 800 ميكرولتر من EGM وقم بإزالة الجل المتبقي بعناية من جدار الإدخال بطرف ماصة صغير (أبيض). قم بزراعة مكافئات الجلد المغمورة في مخطط كهربية الدماغ لمدة 7 أيام في حاضنة خلية عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} ، وقم بتغيير الوسط كل يومين.
   ملاحظه: خلال هذا الوقت ، سوف تتقلص مكافئات الجلد بشكل كبير.

< p class = "jove_title" >5. زراعة الهواء السائل لإعادة بناء الجلد الكامل العضوي

1. في اليوم 8 ، انقل كل ملحق إلى بئر فردي من صفيحة مكونة من 6 آبار. أضف فقط 1.2-1.4 مل من وسط MM إلى كل بئر ، بحيث يتم تزويد إعادة بناء الجلد بوسط من قاع البئر ولكن لا يتم تغطيته بالوسط.
   ملاحظه: تسمح الزراعة في واجهة الهواء والسائل بالتقسيم الطبقي لجزء البشرة وإنشاء طبقة متقرنة كاملة (الطبقة القرنية).
2. خلال الأيام ال 10-17 التالية ، قم بتغيير الوسيط كما هو مذكور في القسم 5.1 كل يومين. خلال هذه الفترة ، أضف الأدوية أو المحفزات الأخرى حسب الحاجة إلى الوسيط. قم بإزالة إعادة بناء الجلد بالكامل بعناية من إدراج الغشاء الصغير الذي يسهل اختراقه باستخدام ملاقط منحنية لمزيد من التحليل ، على سبيل المثال ، التحليل الكيميائي المناعي (الشكل 1).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: زراعة إعادة بناء الجلد العضوي ثلاثي الأبعاد المغمورة بوسط وفي واجهة الهواء السائل. في اليوم 0 ، يتم زرع الخلايا الكيراتينية الأولية أعلى الحجرة الجلدية التي تتكون من الخلايا الليفية الأولية المضمنة في مصفوفة الكولاجين من النوع الأول. تبقى عمليات إعادة بناء الجلد ثلاثية الأبعاد مغمورة بغمور مع EGM لمدة 7 أيام ، وتنفصل عن جدار الإدخال ، وتبدأ في الانكماش. في اليوم 8 ، يتم نقل الإدخا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ألبومين مصل الجنين (FCS) ثيرمو فيشر العلمي 10270106 إضافة 10٪ إلى وسط زراعة الخلايا التربسين EDTA ثيرمو فيشر العلمي 25300054 1X خفف في PBS DMEM ثيرمو فيشر العلمي 41965062 لزراعة الخلايا الليفية الأولية متباينة تقنيات جيبكو لايف 17105041 2U / مل ، يذوب في PBS الكولاجين من النوع الأول BD Biosciences 354249 عادة من ذيل الفئران ، يجب أن يكون التركيز 3.5-4 مجم / مل 24 بئر إدراج Nunclon نونك 140629 حجم المسام 8 ميكرومتر ؛ استخدم الوقوف ، وليس إدراج المعلق مصفاة الخلية بي دي فالكون هاتف: 352360 أصفر جنتاميسين ثيرمو فيشر العلمي 15750060 تذوب في PBS كيرالايف كيراتينسايت وسط أنظمة الخلايا لا تضيف FCS أو المضادات الحيوية كولاجيناز سيرفا 17454 [إ] الصف القياسي NB4 الخلايا الكيراتينية البشرية اليافعة أنظمة الخلايا FC-0007 بديل لإعداد خاص من القلفة الأحداث الخلايا الليفية البشرية اليافعة أنظمة الخلايا إف سي-0001 بديل لإعداد خاص من القلفة الأحداث EGF تقنيات جيبكو لايف 13247-051 أضف 10 نانوغرام / مل فقط لتوليد وسط EGM كلوريد الكالسيوم ميرك للكيماويات 2381 ريال أضف 1.9 ملي مولار لتوليد EGM و 3.8 ملي لمتوسط MM حمض السيلينيك ألفا إيسار 18851 أضف 53 نانومتر لتوليد EGM و MM المتوسطة إنسولين ليلي HI0219 قلم همهمة 3 مل 100 E.I./مل أضف 5 ميكروغرام / مل لتوليد EGM و MM المتوسطة الإيثانولامين سيجما ألدريتش إ-0135 أضف 0.1 ملي مولار لتوليد EGM و MM المتوسطة ف إيثانولامين سيجما ألدريتش ف -0503 أضف 0.1 ملي مولار لتوليد EGM و MM المتوسطة هولو ترانسفيرين سيجما ألدريتش تي -0665 أضف 5 ميكروغرام / مل لتوليد EGM و MM المتوسطة ثلاثي يودوثيرونين سيجما ألدريتش تي -6397 أضف 20 جزء من المليون لتوليد EGM و MM المتوسطة الهيدروكورتيزون سيجما ألدريتش H-088816 أضف 0.4 ميكروغرام / مل لتوليد EGM و MM المتوسطة البروجسترون سيجما ألدريتش ف 8783 أضف 10 نانومتر فقط لتوليد وسط EGM هيبس سيجما ألدريتش إتش -3784 أضف 15 ملي مولار لتوليد EGM و MM متوسط سيرين سيجما ألدريتش إس-4311 أضف 1 ملي مولار لتوليد EGM و MM المتوسطة كلوريد الكولين سيجما ألدريتش سي -7017 أضف 0.64 ملي مولار لتوليد EGM و MM المتوسطة dFCS سيجما ألدريتش F-0392 الكثير 086K0361 إضافة 2٪ لتوليد EGM و MM المتوسطة الادنين سيجما ألدريتش أ -9795 أضف 0.18 ملي مولار لتوليد EGM و MM متوسط ل-جلوتامين PromoCell سي -42209 أضف 7.25 ملي مولار لتوليد EGM و MM متوسط كلوريد السترونتيوم سيجما ألدريتش 255521 أضف 1 ملي مولار لتوليد EGM و MM المتوسطة