$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
1. تحضير خلايا B16-BL6
- قم بإزالة ألواح زراعة الخلايا من الحاضنة بزاوية 37 درجة وضعها في غطاء معقم. يجب أن تكون الصفائح حوالي 70٪ ملتقية مع خلايا الورم الميلانيني الفئراني B16-BL6. قد يؤدي التقاء أكبر إلى تغيير إمكانات الخلايا النقيلية.
- أضف 1 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA لكل طبق ، واتركه لمدة 1 دقيقة ، ثم استنشق محلول وسائط التربسين.
- أضف 1 مل من التربسين لكل طبق وأعد الأطباق إلى الحاضنة لمدة 10 دقائق.
- بعد نقل الألواح من الحاضنة إلى الغطاء المعقم ، أضف 4 مل من وسط معهد روزويل بارك التذكاري الخالي من المصل (RPMI) إلى كل لوحة.
- اجمع الخلايا بماصة معقمة آلية. قم بإخراج الخلايا على الجزء السفلي من اللوحة ، مع الضغط على الطرف بزاوية طفيفة جدا ، لتفتيت الخلايا. كرر عدة مرات لضمان الفصل الكافي لكتل الخلايا ، والتي قد تسد إبرة القذف. تذكر ونقل إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
- استخدم مقياس كثافة الدم لتحديد كثافة الخلية. مع الحفاظ على العدد الإجمالي لخلايا B16-BL6 ثابتا ، حدد حجم RPMI الخالي من المصل اللازم للوصول إلى التركيزات النهائية البالغة 0 و 0.065 و 0.015 و 0.25 و 0.5 مليون خلية / مل.
بالتساوي ، قم بتقسيم - الوسائط في الأنبوب سعة 50 مل إلى 15 مل من الأنابيب المخروطية الشكل. الطرد المركزي الأنابيب المخروطية عند 2,250 × جم لمدة 5 دقائق. صب وسائل الإعلام. أضف حجما مناسبا من RPMI الخالي من المصل وتأكد من كثافة الخلايا المطلوبة عبر مقياس كثافة الدم. اضبط الكثافات عن طريق إضافة RPM إضافي أو الدوران وإعادة التعليق في حجم أصغر وفقا لذلك.
- Aliquot 500 ميكرولتر من كل معلق خلية في أنابيب 1.8 مل على الجليد.
< p class = "jove_title" >
2. حقن الوريد الذيل
- شراء إناث C57BL / 6 الفئران (العمر 6-8 أسابيع), 5 الفئران لكل مجموعة. اترك عدة أيام حتى تتكيف الفئران.
- خذ فأرا ، ممسكا بالذيل ، ووجهه إلى الخلف أولا في مصفاة الماوس. مع وجود الجذع في الغرفة الرئيسية للمقيدة والذيل خارجها ، اسحب الماوس باتجاه نهاية التقييد. أدخل المكبس التقييدي ، واستمر في الدفع حتى يصبح الماوس آمنا.
- قم بتدوير الماوس 90 درجة بحيث يكون أحد عروق الذيل الجانبية متجها لأعلى. باستخدام وسادة كحولية ، قم بتنظيف جانب ذيل الفأر بقوة ، خاصة حيث يكون وريد الذيل أكثر وضوحا.
ملاحظه: الإضاءة الجيدة ضرورية للتصور الفعال للوريد الذيل على الفئران B57BL / 6J. المصابيح الحرارية أو وسادات الجراحة الساخنة ، على الرغم من أنها ليست ضرورية ، ستساعد أيضا عن طريق زيادة حجم الوريد الذيلي.
- في غطاء مزرعة معقم ، اجمع 300 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا من أنبوب 2 مليون خلية / مل. اقلب الإبرة ، ونفض الغبار على الجانب وادفع المكبس ، لإخراج الفقاعات من المحقنة. إخراج ثقافة RPMI للحصول على حجم نهائي يبلغ 250 ميكرولتر.
- مد ذيل الماوس باليد غير المهيمنة. أمسك الذيل مع رفع الطرف القريب من الذيل مع السبابة من اليد غير المهيمنة ، والجزء البعيد من الذيل منخفض بالإبهام.
ملاحظه: بهذه الطريقة ، يتم تثبيت وريد الذيل في وضع جانبي ، بالتوازي مع سطح التقييد ، مع إمكانية الدخول المتطابق في الجزء البعيد من الذيل.
- أدخل الإبرة في الوريد الذيل ، باتجاه الطرف البعيد ، بزاوية دقيقة لأسفل لتبدأ ، ثم اضبط الإبرة لتتناسب مع زاوية وريد الذيل عند مزيد من الإدخال (خفض نهاية المكبس للحقنة بالنسبة للإبرة).
- أدخل الإبرة حوالي 1 سم في وريد الذيل. بعد الإدخال ، ابدأ في دفع المكبس ، مع تثبيت الإبرة.
ملاحظه: إذا كانت الإبرة في وريد الذيل ولم يتم انسداد نهاية الإبرة ، فيجب أن تتدفق الوسائط دون عوائق إلى الوريد. يتميز الحقن الفعال بتصفية الدم من الوريد. إذا كانت هناك مقاومة ، أو بدأت فقاعة في التكون في موقع الحقن ، فقم بإزالة الإبرة وحاول مرة أخرى في مكان أقرب على طول الوريد الذيل.
- قم بإزالة الإبرة من الوريد وتخلص منها. أمسك الشاش على موقع الدخول لوقف أي نزيف.
- قم بإزالة المكبس من المقنع وضع الماوس في قفص المستلم.
- كرر لجميع التركيزات الأخرى.
ملاحظه: يستغرق إنشاء بؤر الرئة حوالي 2-3 أسابيع ، مع التباين اعتمادا على خط الخلية والحجم المطلوب للبؤر. في غضون ذلك ، يجب مراقبة الفئران بحثا عن الأعراض التي قد تستدعي القتل الرحيم المبكر مثل اللهاث المفرط.
< p class = "jove_title" >
3. عد بؤر الرئة
- قم بالقتل الرحيم للفأر عن طريق وضعه في حجرة ثاني أكسيد الكربون2 وتعريضه ل 100٪ من ثاني أكسيد الكربون2 الذي يتم إدخاله بنسبة 10-30٪ من حجم الغرفة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
- العب الماوس على الستايروفوم. باستخدام المقص الجراحي ، قم بعمل شق جراحي على طول القص.
- قم بعمل شقين إضافيين ، كلاهما من أعلى شق القص ومتفرعان باتجاه أكتاف الفأر ، مما يؤدي إلى تعريض القفص الصدري.
- قم بعمل قطعتين ، كل منهما على طول الجانبين الجانبيين من القص ، لإزالة القفص الصدري من الجذع ، مما يؤدي إلى تعريض الرئتين والقلب.
- إمساك القلب بالملاقط الجراحية ، وقطع المريء والقصبة الهوائية ، وتحرير القلب والرئتين من الفأر. ضعه تحت مجهر تشريح ، بتكبير 10X ، للحصول على تصور أفضل.
- قم بتشريح القلب من الرئتين وإزالة الغدة الصعترية ، مع ترك الرئتين فقط.
- مع وجود الرئتين تحت نطاق تشريح ، ابدأ في حساب بؤر الرئة. يجب أن تظهر كل بؤرة على شكل اقتحام دائري بني على سطح الرئتين.
- من أجل الاتساق بين الفئران ، احسب عدد البؤر الموجودة على سطح الفص ، ثم اقلب هذا الفص. يسمح القيام بكل من الفصوص الأربعة على حدة بتسهيل العد.
- حفظ وإصلاح الرئتين في حالة إجراء IHC ، وإلا فتخلص من البقايا.