أسماك HCR-DNA: تقنية تهجين مضان في الموقع للكشف عن الحمض النووي الفيروسي في الخلايا المصابة

الملخص

المصدر: Wei Liu et al. ، عدوى فيروس ورم متعدد خلايا ميركل واكتشافها ، J. Vis. Exp. (2019).

في هذا الفيديو ، تعرضت الخلايا المصابة بفيريونات MCPyV لتفاعل متسلسل تهجين في الموقع للكشف عن جينومات MCPyV المحددة. علاوة على ذلك ، تم دمج تقنية DNA-HCR مع FISH لتصور الحمض النووي MCPyV في خلايا الجلد البشري المصابة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. العدوى

1. الحفاظ على الخلايا الليفية الجلدية البشرية الأولية في DMEM مع مصل ربلة الساق الجنينية بنسبة 10٪ ، و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية ، و 1٪ L-glutamine. عند الوصول إلى التقاء ، انقسم الخلايا الليفية 1: 4 دون الدوران لأسفل.
   ملاحظه: للحصول على أعلى كفاءة للعدوى MCPyV ، استخدم الخلايا الليفية الأولية بين الممرات 5 و 12 التي تنقسم بنشاط في وقت الطلاء.
2. لإصابة الخلايا الليفية الجلدية البشرية ، قم بشفط الوسط وغسل الخلايا باستخدام DPBS.
3. أضف 1 مل من 0.05٪ Trypsin-EDTA إلى الطبق واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق.
4. تحقق تحت المجهر للتأكد من خروج الخلايا من الطبق.
5. أضف 10 مل من وسط DMEM / F12 الذي يحتوي على 20 نانوغرام / مل EGF و 20 نانوغرام / مل bFGF و 3 ميكرومتر CHIR99021 ، وكلها تحفز عدوى MCPyV ، إلى الطبق وانقل محلول الخلية إلى أنبوب 15 مل.
6. قم بتدوير الخلايا عند 180 × جم لمدة دقيقتين وتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في وسط DMEM / F12 الذي يحتوي على 20 نانوغرام / مل EGF و 20 نانوغرام / مل bFGF و 3 ميكرومتر CHIR99021 عند 2-4 × 10⁴ خلايا لكل مل.
7. بذرة 200 ميكرولتر من معلق الخلية مكملة ب 1 مجم / مل من الكولاجيناز من النوع الرابع في كل بئر من صفيحة 96 بئر. قم بإذابة مخزون فيريون MCPyV على الجليد. أضف 10⁹ مكافئ جينوم فيروسي من فيريونات MCPyV لكل 1 ميكرولتر من اليوديكسانول لكل 2,500 إلى 5,000 خلية مصابة. اضغط على جانب اللوحة برفق وضع اللوحة في الحاضنة.
8. بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 48-72 ساعة ، أضف 20٪ FBS إلى كل بئر.
9. اسمح للعدوى بالمضي قدما عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 72-96 ساعة.

< p class = "jove_title" >2. في الموقع DNA-HCR

1. قم بإصلاح الخلايا المزروعة على أغطية تحتوي على 4٪ PFA في PBS لمدة 10 دقائق. اغسل الأغطية مرتين باستخدام PBS ، ثم عالجها بنسبة 70٪ من الإيثانول لاختراق الخلايا عند 4 درجات مئوية طوال الليل><. ملاحظه: يمكن أن تبقى العينات الثابتة في هذه الحالة لعدة أيام.
قم
2. بتهجين العينات مسبقا عن طريق استبدال الإيثانول بمخزن مؤقت لتهجين المسبار واحتضانه لمدة 60 دقيقة في RT.
3. قم بتخفيف المسبار (المسبار) (1 ميكرومتر) (الجدول 1) في محلول مخزن مؤقت لتهجين المسبار عند 1: 500 تخفيف قبل 30 دقيقة من نهاية خطوة ما قبل التهجين واحتضانه عند 45 درجة مئوية.
4. في نهاية الحضانات ، يتم استخدام الماصة ~ 10 ميكرولتر من مزيج المسبار المخفف لكل غطاء على شرائح المجهر. ضع الغطاء ، بحيث يكون جانب الخلية لأسفل ، على قطرات كل منها من مزيج مسبار التهجين. أغلق حواف وظهر الغطاء على الشرائح بكمية كبيرة من الأسمنت المطاطي.
5. قم بتسخين الشرائح باستخدام مجسات إضافية عند 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق عن طريق وضع الشرائح على الجانب المسطح من كتلة الحرارة. انقل الشرائح إلى غرفة رطبة واحتضانها عند 45 درجة مئوية طوال الليل. لعمل غرفة رطبة بسيطة ، قم بترطيب المناشف الورقية المعقمة برفق مع dH₂O وضعها في قاع وعاء بلاستيكي يغلق بحشية مطاطية.
   ملاحظه: أثناء التسخين ، يمكن أن ينفجر الأسمنت المطاطي لفترة وجيزة. ومع ذلك ، تأكد من عدم كسر الختم.
6. قشر الأسمنت المطاطي بحذر باستخدام ملقط وضع الغطاء جانب الخلية لأعلى في آبار من صفيحة 24 بئرا. اغسل الغطاء باستخدام مخزن غسيل المسبار عند RT ثلاث مرات.
7. احتضان الغطاء في المخزن المؤقت للتضخيم (200 ميكرولتر في ألواح 24 بئرا) عند RT لمدة 30-60 دقيقة.
8. وفي الوقت نفسه ، قم بتلدين كل من دبابيس الشعر قليلة النوكليوتيد المسماة للتعرف على المجسات (الجدول 1) في أنابيب PCR منفصلة عن طريق التسخين إلى 94 درجة مئوية لمدة 90 ثانية والتبريد إلى RT لمدة 30 دقيقة مع الحماية من الضوء. امزج دبابيس الشعر في المخزن المؤقت للتضخيم ، كل منهما عند تخفيف 1:50.
9. اصنع سطحا لتفاعل التضخيم عن طريق مد فيلم البارافين على الوجه المفتوح لغطاء لوح مكون من 24 بئرا. ماصة 50-100 ميكرولتر قطرات من خليط دبوس الشعر/التضخيم على طبقة البارافين لكل غطاء. استخدم الملقط لإزالة الغطاء بعناية من محلول التضخيم المسبق. جفف الغطاء عن طريق لمس الحافة بمنديل مسامي يمكن التخلص منه ، وضع جانب الخلية لأسفل على قطرة التضخيم.
10. ضع غطاء اللوحة الذي يحمل الغطاء في غرفة رطبة واحتضنه طوال الليل في RT في الظلام.
11. أعد الغطاء إلى الآبار مرة أخرى. احتضان العينات ب 5x SSCT [5x كلوريد الصوديوم سترات الصوديوم (SSC) 0.1٪ Tween 20 تمت ترشيحه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر] يحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل DAPI لمدة ساعة واحدة في RT. اغسل العينات مرتين باستخدام 5x SSCT في RT.
12. قم بتركيب أغطية على شرائح المجهر. قم بتحليل الخلايا وتصوير العينات باستخدام مجهر مضان مقلوب.

مسبار MCPyV 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA tgagctacctcactaaggagtggtttttatactgcagtttcccgcccttg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCCAC مسبار MCPyV 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agaggcctcggaggctaggagcccaagcctctgcccacttgaa ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCCAACTCTCTCAC مسبار MCPyV 3
CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cattgactttcctggagaggcggagtttgactgataaacaaaacttt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC مسبار MCPyV 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gatactgcctttttgctaattaagcctcttaagcctcagagtcctctct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCCAC مسبار MCPyV 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcttctcctgtaagaatagcttccaaagttactcctgtggtggcactt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCCACTCTCCAC مسبار MCPyV 6 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ggatgttgccataacaattaggagcaatctccaagcttgcacagagcc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCCACTCTCCAC مسبار MCPyV 7 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gctcaggggaggaaagtgattcatcgcagaagagatcccccaaggtgcca ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCCACTCTCAC مسبار MCPyV 8 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA aagcctgggacgctgagaaggacccatacccagaagagctctggctg ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCTCAC مسبار MCPyV 9 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA agcttcgggacccccaaattttcgctttcttgaatggaggaggtc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCTCAC مسبار MCPyV 10 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cttttggctagaacagtctgcggcttgttggcaaatggttttgaga ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCTCAC مسبار فيروس الورم الحليمي البشري 1 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA cagctctgtgcataactgtggtaactttgggtgtcgctcctgtgggtct ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCCACTCCCTCTCAC مسبار فيروس الورم الحليمي البشري 2 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA acaatattgtaatgggctctgtccggttgtgtgtccagctggaccatc ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCCACTCTCAC مسبار فيروس الورم الحليمي البشري 3 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA gtcagctatactgggtgtaagtccaaatgcaatacccaac ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCAC مسبار فيروس الورم الحليمي البشري 4 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ctttggtatgggtcgcggcgggggtggggccaagtgctgcctaataatt ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCAACTCTCTCAC مسبار فيروس الورم الحليمي البشري 5 CCTCAACCTACCTCCAACTCTCACCATATTCGCTTC TAAAA ccatccattacccccgtaccctctcccccattggtacctgcaggatcag ATTTT CACATTTACAGACCTCAACCTACCTCCCACTCTCAC

الجدول 1: المجسات المستخدمة في الدراسة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مخزن مؤقت تهجين التحقيق < td class = "xl64" > التقنيات الجزيئية < td class = "xl64"> < td class = "xl64"> المخزن المؤقت للغسيل < td class = "xl64" > التقنيات الجزيئية < td class = "xl64"> < td class = "xl64"> < td class = "xl64" > المخزن المؤقت للتضخيم < td class = "xl64" > التقنيات الجزيئية < td class = "xl64"> < td class = "xl64"> فئة دبابيس شعر Alexa 594 < td class = "xl64" > التقنيات الجزيئية < td class = "xl64" >B4 < td class = "xl64" > الحماية من الضوء Paraformaldehyde < td class = "xl65" > سيجما < td class = "xl65" >P6148 < td class = "xl65">