تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
< p class = "jove_title" >
1. عزل الخلايا الكيراتينية عن جلد الإنسان
- ابدأ بعمل الحلول التالية: محلول 50 مل من 0.25٪ تريبسين و 0.1٪ جلوكوز في DPBS. امزج وقم بتعقيم المحلول (0.2 ميكرومتر). تحضير 10 مل من محلول RPMI-1640 + 2٪ FBS ، و 50 مل من DPBS والوسط الخالي من مصل الخلايا الكيراتينية (KSFM). أضف مكملات KSFM و 250 ميكرولتر من الجنتاميسين إلى 500 مل من KSFM. قم بتسخين المحاليل مسبقا إلى 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- اجمع الجلد من المتطوعين البالغين الأصحاء الذين يخضعون لجراحة تجميلية. يبلغ حجم عينات الجلد المستخدمة حوالي 10 سم × 15 سم ولكن يمكن أن يختلف حجمها. حافظ على برودة الجلد أثناء النقل عن طريق نقل عينات الجلد في صندوق من الستايروفوم يحتوي على عنصر تبريد. إذا لزم الأمر ، يمكن تخزين عينة الجلد عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- قم بإزالة الدهون من أسفل قسم الجلد باستخدام مقص ومشارط وملقط معقمة.
- اربط الجزء من الجلد (حوالي 10 سم × 15 سم) على غطاء معقم أعلى الطبق باستخدام الإبر. أولا ، نظف الجلد باستخدام وسادة شاش جافة معقمة. ثم نظف الجلد باستخدام وسادة شاش معقمة تحتوي على 70٪ إيثانول.
- باستخدام مسوي القدم ، اقطع الطبقة العليا (البشرة) من قسم الجلد وضعها في طبق بتري 9 سم. بعد ذلك ، أضف على الفور 25 مل من محلول DPBS / التربسين / الجلوكوز (المحضر في الخطوة 1.1) إلى طبق بتري. احتضن لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- باستخدام ماصة، قم بإزالة محلول DPBS / التربسين / الجلوكوز من طبق بتري وأضف 10 مل من RPMI-1640 + 2٪ FBS لتعطيل التربسين.
- باستخدام ملقطين ، حرر الآن خلايا البشرة في الوسط عن طريق كشط وتحريك كل من البشرة والحيز الجلدي لأقسام الجلد برفق.
- قم بتصفية معلق خلية البشرة من خلال مرشح معدني (حجم ثقب 1 مم) ، واجمعها في أنبوب سعة 50 مل. أضف أقسام الجلد المتبقية إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 10 مل من RPMI-1640 بدون FBS والدوامة لمدة 10 ثوان. قم بتصفية التعليق من خلال المرشح المعدني إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على معلق خلايا البشرة. أضف DPBS إلى الحجم الإجمالي البالغ 50 مل.
- الطرد المركزي لتعليق الخلية لمدة 10 دقائق عند 450 × جم في درجة حرارة الغرفة.
- قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات خلية البشرة في حوالي 10 مل من 37 درجة مئوية KSFM اعتمادا على حجم حبيبات الخلية. عد الخلايا باستخدام طريقة تلطيخ Trypan Blue تحت المجهر. يبلغ عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من قسم الجلد 10 سم × 15 سم حوالي 50-100 × 106 خلايا. إلى كل قارورة استزراع 75 سم2 ، انقل 8 × 106 خلايا مع 12 مل من 37 درجة مئوية KSFM. رج قوارير الثقافة برفق لضمان التوزيع المنتظم للخلايا.
- احتضان الخلايا الكيراتينية في حاضنة 37 درجة مئوية مع رطوبة 100٪ و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. قم بتغيير الوسيط بعد يومين وثلاث مرات أسبوعيا. خلايا المرور عندما تكون الثقافة 70-80٪ ملتقية ، الأمر الذي يستغرق حوالي أسبوعين اعتمادا على معدل تكاثر الخلايا الكيراتينية.
